膜片钳常见问题解答汇总
丁香园膜片钳技术讨论区资料汇编
丁香园膜片钳技术讨论区资料汇编整理人：xiaoxuanzi发起人：tianx7752006年6月目录第一节膜片钳技术介绍 (1)应用 (1)基本概念 (2)第二节仪器操作和维护 (3)仪器的使用 (3)噪声 (4)玻璃微电极的制备 (5)第三节实验操作 (7)1.细胞的分离、培养 (7)(1)心肌细胞 (7)(2)平滑肌细胞 (17)(3)其他细胞 (19)2.电极的拉制与电镀 (23)3.电极内外液与渗透压 (25)4.串联、封接、电极电阻 (28)5.补偿 (37)6.刺激方案 (40)7.动作电位记录 (42)8.电流记录 (42)(1)钙电流 (42)(2)钾电流 (45)(3)钠电流 (47)(4)其他电流 (48)9.穿孔 (50)10.单通道记录 (51)11.脑片 (54)12.数据分析与处理 (55)第四节 相关电子文献及书籍 (61)第一节 膜片钳技术介绍一、应用1.全细胞记录技术的应用[Cactuswzw]（1）离子通道宏观性质的分析，例如，离子通道的性质和分类(电压门控通道、膜受体激活通道、配体门控通道、胞内第二信使激活通道等)（2）离子通道微观性质分析，例如单一离子通道活动的测定的测定，离子通道的构造，分布和机能的分析等。
（3）膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究。
（4）胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测。
（5）组织切片的全细胞记录。
(6)植物细胞的电生理研究。
二、基本概念1.刚刚接触patch，有些概念都很模糊holding potential与command potential？Axon200B的放大器控制面板上有ext. command，又是什么东东？都分别什么时候给予？在我理解，pipette capacity compesation就是快电容补偿，而Cm补偿为慢电容补偿，那为何Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节扭？[baxiansheng]Holding potential 是钳制电压，这是实验中从头至尾通过电极用于钳制细胞的一个电压，和膜电位的关系取决于采用的实验模式。
模具钳工常见问题解答1000例3.doc
1：金属结构的主要形式有哪些？答：有框架结构、容器结构、箱体结构、一般构件结构。
２：铆工操作按工序性质可分为几部分？答：分为备料、放样、加工成型、装配连接。
３：金属结构的连接方法有哪几种？答：有铆接、焊接、铆焊混合联接、螺栓联接。
４：在机械制造业中铆工属于（热加工类）。
５：什么叫热加工？答：金属材料全部或局部加热加工成型。
６：珩架结构是以什么为主体制造的结构？答：是以型材为主体。
７：容器结构是以什么为主体制造的结构？答：是以板材为主体。
８：箱体结构和一般结构是以（板材）和（型材）混合制造的结构。
９：备料是指（原材料）和（零件坯料）的准备。
１０：钢板和型材在（运输、吊放、储存）的过程中可造成变形。
１１：钢材的变形会影响零件的（吊运、下料、气割）等工序的正常进行。
１２：零件在加工过程中产生的变形如不进行矫正，则会影响结构的（正确装配）崐１３：焊接产生的变形会降低装配的（精度），使钢结构内部产生附加应力，影响（构件的强度）。
１４：扁钢的变形有（弯曲、扭曲、弯扭复合变形）。
１５：多辊矫正机根据轴辊的排列形式和调节辊的位置可分为哪几种？答：可分为上下辊列平行矫正机、上下辊倾斜矫正机。
１６：火焰校正的加热方式有哪些？答：有点状、线状、三角形加热。
１７：火焰矫正的效果由什么因素决定？答：由加热的位置和加热温度决定。
１８：矫正的方法有哪些？答：机械校正、手工矫正、火焰矫正、高频热度铰正。
１９：什么是制作金属结构的第一道工序？答：放样和号料是制作金属结构的第一道工序。
２０：放样与号料对产品的影响有哪些？答：它将直接影响产品质量对生产周期及成本都有直接影响。
２１：放样常用的量具有什么？答：有木折尺、直尺、钢卷尺、钢板尺等。
２２：放样常用的工具有什么？答：有划规、地规、样冲、划针、小手锤。
２３：实尺放样的程序是什么？答：程序是线型放样、结构放样、展开放样。
２４：展开放样的内容有什么？答：有板厚处理、展开作图、制作号料样板。
膜片钳之问题汇总
膜片钳网上问题收集汇总膜片钳之实验操作篇1、消化分离海马锥体细胞时，应该通氧气？不用通氧，直接放入CO2 孵箱里就行了。
电极内液应该过滤完分装入EPPENDORF 管，用时再拿出来。
尽量避免污染。
另外，环境中的灰尘也要考虑。
细胞外液要及时清洗。
2、全细胞破膜以后串联电阻总是在不断上升，膜渐渐的又融合起来了。
有没有什么办法解决串联电阻上升是由于破膜不完全，或者电极内液有污染堵塞电极所至。
解决方法：适当增大电极的口径，以利于破膜；电极内液使用前一定用0.22目滤器过滤；灌注电极液的器具也要保持洁净；电极现用现拉；电极下降入细胞外液时给予一定的正压防止此过程中灰尘堵塞电极。
3、破膜以后封接电阻有所降低的话，会不会影响记录到的动作电位？通常情况下offset调0，是在zero程序下，holding在0，给一个5-10mv，持续2ms的电压刺激，然后用offset补偿电极尖端电位。
axon 破膜后电阻当然会下降，根据我的经验瞬时电阻应在100M以上，之后会上升，以稳定在500M以上的为佳，越高越好。
4、第一军医大学高天明教授组分离大鼠海马神经元的方法：脑片的制备与神经元的急性分离成年Wistar大鼠(200~250 g)麻醉后(水合氯醛40 mg/100 g)迅速断头取脑, 置于0~4℃的高浓度蔗糖溶液中冷冻约2 min, 再用振动切片机(World Precision Instruments MA752-045)切成400 μm厚的脑片。
高浓度蔗糖溶液的成分为(mmol/L): 蔗糖 234、 KCl 2.5、 Na2HPO4 1、 MgSO4 4、 CaCl2 0.1、 HEPES 15、葡萄糖 11、用1 mol/L的NaOH调pH值至7.3。
将切好的脑片置于通以95% O2+5% CO2混合气的EBSS液中孵育1~6 h (室温), 然后将脑片移入低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中, 并在解剖显微镜下用细解剖针按Paxinos图谱所示, 将海马CA1区含锥体细胞层的一小块组织从脑片上分割下来, 将组织块放入用100% O2饱和的HBSS液中(33℃)用链白蛋白酶(protease XIV, 1.1~1.4 mg/ml)消化30~45 min后取出, 置于低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中清洗3次, 用尖端经火抛光处理的吸管(口径依次为500、 300和150 μm)将之吹打成细胞悬液, 并移数滴至盖玻片上。
自动膜片钳系统安全操作及保养规程
自动膜片钳系统安全操作及保养规程前言自动膜片钳系统是一种高精度和高效率的加工工具，广泛应用于电子、机械、航空等领域。
本文将介绍自动膜片钳系统的安全操作和保养规程，以确保使用者的安全和系统的可靠性。
安全操作规程1. 在操作前的准备工作在使用自动膜片钳系统前，操作者应该进行以下准备工作：1.熟悉自动膜片钳系统的结构、原理、使用方法、操作规程和注意事项。
2.检查自动膜片钳系统的安全保护装置和紧急停止装置是否正常。
3.检查自动膜片钳系统的电源、水源、气源等供应设施是否正常。
4.清理自动膜片钳系统的工作区域和周边环境，保持干净整洁。
2. 在操作中的注意事项1.使用自动膜片钳系统时，必须穿戴个人防护用品，如手套、安全眼镜、口罩等。
2.操作前应检查自动膜片钳系统的刀具、夹具、钳口等部件是否固定牢固、安全可靠。
3.在操作自动膜片钳系统时，必须按照操作规程逐步进行，不得随意更改操作顺序，以免损坏设备或造成安全事故。
4.不要在自动膜片钳系统正常工作状态下随意拆卸和更换设备部件，必须在设备停止运转后方可进行。
5.在操作过程中，要经常检查自动膜片钳系统的各个部件的运行状态，如异常立即停机排查。
3. 在操作后的注意事项1.在完成自动膜片钳系统加工任务后，及时清理设备内外的各个部位和压缩气源系统管道。
2.将自动膜片钳系统的控制器设置到初始状态。
3.关闭自动膜片钳系统的电源、气源、水源等设备供应装置。
4.将设备周围区域清理干净，注意突出部位。
保养规程1. 定期维护正常使用自动膜片钳系统需要进行定期维护。
具体规定如下：1.安排专人进行设备日常维护，定期进行设备清洁、润滑、检测等工作。
2.对自动膜片钳系统的各个零部件进行定期检查，及时修复、更换。
3.遵守生产厂家所提供的保养手册，根据保养指南进行设备保养。
2. 定期校验为了确保自动膜片钳系统的精度和可靠性，需要定期进行校验和调整。
1.进行设备日常巡检和记录，及时发现和解决可能出现的问题。
模具钳工常见问题解答1000例
模具钳工常见问题解答1000例(全) 时间：2009-01-11 13:13:13 来源：中国模具视频网作者：ugproe浏览：462 收藏投稿１：什么叫图样?答：能够准确表达物体的形状大小及技术要求的作图。
２：什么叫投影图？答：就是一组射线通过物体向预定平面上所得到的图形的方法。
３：投影法的分类有几种？答：可分为中心投影法和平行投影法，平行投影法又分为正投影和斜投影。
４：什么叫剖视图？答：一组平行的光线通过物体在投影面上得到的图形５：物体投影的三个基本视图是什么？答：是主视图、俯视图、左视图。
６：三视图的投影规律是什么？答：主、俯视图长对正；主、左视图高平齐；俯、左视图宽相等。
７：金属的物理性能包括哪些内容？答：包括密度、熔点、热膨胀性、导电性和导热性。
８：什么叫熔点？答：是金属由固态转变成液态时的温度。
９：什么叫金属的化学性能？答：是指金属材料在室温或高温下抵抗其周围化学介质对它侵蚀的能力。
１０：化学性能包括哪些？答：包括抗氧化性和耐腐蚀性。
１１：什么叫抗氧化性？答：在室温或高温下抗氧化的能力。
１２：什么叫耐腐蚀性？答：在高温下抵抗水蒸气等物质腐蚀的能力。
１３：什么叫机械性能？答：指金属材料抵抗外力作用的能力。
１４：机械性能包括哪些？答：包括强度、硬度、塑性、韧性、疲劳强度等。
１５：什么叫变形？答：指金属材料在外力作用下形状和尺寸发生的变化。
１６：金属材料的变形可分为哪几种？答：可分为拉伸、压缩、弯曲、扭曲和剪切。
１７：什么叫弹性极限？答：指材料在弹性阶段所能承受的最大力。
１８：什么叫屈服强度？答：指材料在出现屈服现象时所能承受的最大应力。
１９：什么叫抗拉强度？答：指材料在拉断前所能承受的最大应力。
２０：什么叫塑性？答：指材料容易产生变形而不致断裂的性质。
２１：什么叫材料的硬度？答：指材料抵抗其它物体压入其表面的能力。
２２：硬度的表述方法有哪几种？答：有布氏硬度、洛氏硬度、维氏硬度。
２３：什么叫金属材料的工艺性能？答：指金属材料的性能是否易于加工成型。
膜片钳如何消除噪音
膜片钳实验系统震动消除和噪声消除震动的消除方法通过仔细的设计，是可以避免震动的危害，例如在半夜的地下室，各种白天的震动都消失了。
但预防震动比仅仅靠小心更重要。
需要一个用来补偿微操纵器的复杂的空气隔离实验台和一个稳定良好设计的微操纵器。
微操纵器必须是坚固而紧凑的。
因此其移动部分(包括从微操纵器Holder、电极尖端、到chamber中的细胞)，这部分应尽可能短。
微操纵器应靠近chamber，应直接安装在显微镜平台上。
记录放大器的headstage，应直接固定在微操纵器上(而不要挂在一个杆子上)，电极也应该短。
在做膜片钳记录时，最好使用远程控制微操纵器以消除手的震动。
现在，有3种主要类型的远程控制微操纵器：压电驱动、电机驱动、液压/气压驱动。
1 压电微操纵器坚固紧凑，有优异的长期稳定性，且移动非常平滑，没有改变方向时的后冲。
(Burleigh PCS5x00, PCS6x00系列)2 电机微操纵器坚固紧凑。
但是，它们常常缓慢而笨拙地到位，在改变方向时，可能出现后冲。
3 而液压/气压微操纵器驱动非常快，很方便，且没有后冲，但有些型号在用于特定的设置时，可能发生缓慢的漂移。
非常适合做注射微操。
防震台一般包括一个很重的厚板，放在气垫支持上。
这样的防震台都比较昂贵。
但是，自制的防震台也是可选的，例如将厚板放置在部分充气的内胎或网球上，特别是使用了高品质的微操纵器之后，一般可以不用昂贵的气垫防震台。
噪声消除方法外来的电气影响(非仪器内部噪声)，可归类为3种：辐射拾取，磁感应拾取，地环路噪声。
辐射拾取辐射拾取的例子包括：从灯源和电源插座来的工频噪声(嗡嗡声hum)；计算机来的高频噪声。
这种类型的噪声一般可以通过如下方法削减：在chamber和电极周围放置导体屏蔽层，使用带屏蔽的BNC电缆。
屏蔽层连接到微电极放大器的信号地。
一般的，法拉第屏蔽笼可以用来屏蔽微电极和chamber。
作为替代，下列方法也能削减噪声：(1)(1)找到噪声源，使用一个开路的示波器探针，并屏蔽它。
膜片钳之仪器操作与维护篇
膜片钳之仪器操作与维护篇1、电极一旦拉制成功后，其尖端必须作进一步的处理。
目的之一是为了减小电极内部与溶液之间的电容，即在电极末梢前数微米处，涂敷一层疏水材料，如硅酮树脂（Sylgard）。
这种物质能够防止液膜爬上电极。
另一目的是为了对电极尖端作优化处理，如同热抛光的方法使电极尖端光滑、周围均匀，以提高实验过程中的封接成功率。
2、关于电极的问题a. 洁净的电极是封接的关键。
电极需要在使用前拉制完成放在密闭容器中，通常在12小时内用掉比较好；b. 内液（确切的说是电极液）需要过滤；c. 在电极入水之前可以加一个正压，可以吹开电极尖端的液体及灰尘；d. 如果不用灌流的话，最好bath solution也要过滤。
e、电极拉制成功以后，常置于一有盖的容器内，2-3小时内必须使用，电极使用前要进行充灌。
在充灌前，电极内液要用的滤膜或滤纸进行过滤。
利用玻璃管的虹吸作用，溶液可从电极尖端吸入，也可利用5ml注射器在尾端加负压以实现充灌，随后电极从尾端充灌。
电极内液不能漏到夹持器，会使其内表面变湿形成薄膜从而产生热噪声，在充灌时，电极内出现的气泡可以通过轻敲电极而消失。
3、降低噪声的关键是地线和屏蔽，第一地线接地要好；第二要注意将一些容易产生噪声的设备屏蔽好，比如显微镜灯光的电源、电动微超的马达、监视和记录的电脑以及一些可能产生噪声的电源线，总之你可以用排除法一一试验，肯定会降低噪声的，一般降低到几个pA/fA级即可。
另外，你的负压也可以用一个“U”形管通过3通管加上。
我认为屏蔽很重要哦，以前我在实验中，常遇到电极入水后方波有50HZ干扰，有时还跳动，很是心烦，想了很多办法就是去不掉，包括接地线，镀银丝、参比电极，清洗Holder等等，甚至怀疑仪器有问题，感到有些绝望了！后来发现灌流时干扰明显，把灌流装置控制电源搬到法拉第笼子外，一切就ok了！而且发现只要有电源线进入屏蔽笼，即使没有通电，也有交流干扰，所以所有进入屏蔽笼的电源线都应该用屏蔽线（而不是一般电线）。
膜片钳技术
2008级硕士研究生膜片钳技术试题请用A4纸书面手写，严禁抄袭。
下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！问答题（共100分）1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。
膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。
实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。
2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？答：膜片箝有四种分类：（1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode）微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。
此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。
该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。
但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。
(2)全细胞记录法(Whole-cell recording)在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。
膜片钳技术原理及相关基本知识0306
失活 状态
Inactive state
复活
recovery
静息 状态
resting state
开放 状态
激活
activation
open state
离子通道的功能
(Function of Ion Channels)
1.产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。
2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、 学习和记忆 3.维持细胞正常形态和功能完整性
• 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后 者仅发现于内皮细胞和心肌细胞
• 水通道
2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
电生理学研究简史：
• 二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。 • 1825 年， Nobili 发明了电流计，用其证实了肌 •
肉有电流存在。 1912 年， Bridge 确定了 AP 的“全或无”现象。 同年，Oxford提出了突触的概念及反射弧的生 理学研究，获1932年Nobel奖。
• 1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴 •
离子通道结构研究：目前，绝大
多数离子通道的一级结构得到了阐明 ，但最根本的还是要搞清楚各种离子 通道的三维结构，在这方面，美国的 二位科学家彼得· 阿格雷和罗德里克· 麦 金农做出了一些开创性的工作，他们 利用X光绕射方法得到了K离子通道的 三维结构，二位因此获得2003年诺贝 尔化学奖。有关离子通道结构不是本 PPT的重点，可参考杨宝峰的≪离子通 道药理学≫和Hill的≪ Ionic Channels Of Excitable Membranes ≫. .
膜片钳常见问题解答
膜片钳常见问题解答膜片钳常见问题解答（一）1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。
由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。
膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。
从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。
随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。
2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S），旧称姆欧，即安培/伏特。
常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12 S，1,000 pS＝1 pA/mV。
3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的 ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么区别?答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。
后者的灵活度大，因此多采用。
目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Raw output了。
若你想记录两个输出，则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。
4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用围？答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。
钳子使用中的常见问题及解决方法
钳子使用中的常见问题及解决方法钳子作为一种常见的手工工具，在我们的日常生活和工作中扮演着重要的角色。
然而，很多人在使用钳子时常常遇到一些问题，例如使用不当导致的损坏、操作不便等。
本文将就钳子使用中的常见问题进行探讨，并提供相应的解决方法。
一、钳子夹持力不足在使用钳子时，有时会出现夹持力不足的情况，导致无法牢固地夹住物体。
这可能是由于钳子的夹持面磨损或者弹簧松弛所致。
解决方法：1. 检查钳子的夹持面是否磨损，如有磨损可以使用砂纸或磨刀石进行打磨，使其恢复光滑。
2. 如果是弹簧松弛导致的夹持力不足，可以尝试调整钳子的弹簧张力。
有些钳子的弹簧张力可以通过旋转螺丝或调节螺母来实现。
二、钳子夹持面不平整有时钳子的夹持面会出现不平整的情况，这会影响到钳子的夹持效果。
解决方法：1. 检查钳子的夹持面是否有凹陷或凸起，如果有，可以使用锉刀或砂纸进行修整，使其恢复平整。
2. 如果是钳子的夹持面受到腐蚀导致不平整，可以使用去锈剂进行清洁，然后再进行修整。
三、钳子使用不便有时候在使用钳子时，可能会感觉到操作不便，例如手感不好、夹持力不稳等情况。
解决方法：1. 检查钳子的手柄是否有刺手的地方，如果有，可以使用砂纸或磨刀石进行打磨，使其光滑。
2. 如果是钳子的手柄太粗或太细导致手感不好，可以尝试使用手套或加装手柄套来改善手感。
3. 如果钳子的夹持力不稳，可以检查钳子的螺旋传动部分是否松动，如果松动可以使用扳手进行紧固。
四、钳子损坏修复在使用钳子过程中，有时会发生钳子损坏的情况，例如钳嘴断裂、手柄折断等。
解决方法：1. 如果是钳嘴断裂，可以尝试使用焊接修复。
首先将断裂的部分进行清洁，然后使用适当的焊接材料进行修复。
注意选择合适的焊接材料和方法，以保证修复效果。
2. 如果是手柄折断，可以尝试使用胶水进行粘合。
首先将折断的部分进行清洁，然后使用合适的胶水进行粘合。
注意选择适合材质的胶水，并确保粘合牢固。
总结：钳子是一种常见的手工工具，在使用过程中可能会遇到一些问题，例如夹持力不足、夹持面不平整、使用不便等。
膜片钳之仪器操作与维护篇.
膜片钳之仪器操作与维护篇1、电极一旦拉制成功后，其尖端必须作进一步的处理。
目的之一是为了减小电极内部与溶液之间的电容，即在电极末梢前数微米处，涂敷一层疏水材料，如硅酮树脂（Sylgard）。
这种物质能够防止液膜爬上电极。
另一目的是为了对电极尖端作优化处理，如同热抛光的方法使电极尖端光滑、周围均匀，以提高实验过程中的封接成功率。
2、关于电极的问题a. 洁净的电极是封接的关键。
电极需要在使用前拉制完成放在密闭容器中，通常在12小时内用掉比较好；b. 内液（确切的说是电极液）需要过滤；c. 在电极入水之前可以加一个正压，可以吹开电极尖端的液体及灰尘；d. 如果不用灌流的话，最好bath solution也要过滤。
e、电极拉制成功以后，常置于一有盖的容器内，2-3小时内必须使用，电极使用前要进行充灌。
在充灌前，电极内液要用0.2um的滤膜或滤纸进行过滤。
利用玻璃管的虹吸作用，溶液可从电极尖端吸入，也可利用5ml注射器在尾端加负压以实现充灌，随后电极从尾端充灌。
电极内液不能漏到夹持器，会使其内表面变湿形成薄膜从而产生热噪声，在充灌时，电极内出现的气泡可以通过轻敲电极而消失。
3、降低噪声的关键是地线和屏蔽，第一地线接地要好；第二要注意将一些容易产生噪声的设备屏蔽好，比如显微镜灯光的电源、电动微超的马达、监视和记录的电脑以及一些可能产生噪声的电源线，总之你可以用排除法一一试验，肯定会降低噪声的，一般降低到几个pA/fA级即可。
另外，你的负压也可以用一个“U”形管通过3通管加上。
我认为屏蔽很重要哦，以前我在实验中，常遇到电极入水后方波有50HZ干扰，有时还跳动，很是心烦，想了很多办法就是去不掉，包括接地线，镀银丝、参比电极，清洗Holder等等，甚至怀疑仪器有问题，感到有些绝望了！后来发现灌流时干扰明显，把灌流装置控制电源搬到法拉第笼子外，一切就ok了！而且发现只要有电源线进入屏蔽笼，即使没有通电，也有交流干扰，所以所有进入屏蔽笼的电源线都应该用屏蔽线（而不是一般电线）。
电生理膜片钳技术教学中的一些心得_林显光
位。但是，其实用这种记录方式来描述常见的动作电位记录 是不准确的。目前使用膜片钳系统进行的动作电位记录，大 多数是单电极测试，也就是从同一根探头给出去极化刺激并 且同时检测膜电流的变化来测定动作电位。这两种情况下， 动作电位产生的原理是相同的，可以说反映了类似的细胞活 动，但是不能完全等同起来，后者的采集过程中，细胞处于一 个较长时间的胞内电势去极化的状态，主要用来测试细胞动 作电位的发放频率（Fire rate），而前者主要用来测试细胞对于 某种短促刺激的响应能力，这里需要着重给学生分析清楚。
而对于一些针对特别具体实验的内容，如怎样制备大鼠脑片、 怎样进行海马脑片记录、怎样在新生大鼠离体脑干——脊髓 标本上进行实验等，则不必列入课程范围内，因为在学生可以 查找到的文献中有更新、更完备、更切合实际工作的方法，不 需要在课堂上进行这些内容的训练。我们课程的宗旨是让学 生理解膜片钳系统的工作原理，并指导其将具体实验与放大 器原理结合起来进行科研工作，而非手把手地进行实验方法 教学，何况这些教科书上的实验方法很容易被时间所淘汰。至 于教材中关于如何连接数模转换线路、如何使用某一种采集 软件的内容，也不必列为教学内容。因为这些都是在仪器说 明书中所包含的内容，并且随着设备的更新换代会有所改变， 学生可以通过阅读说明书来获得更准确的信息。
3 授课教师应该对膜片钳有深入的理解 膜片钳技术从表面上看只是对膜片钳放大器相关系统的 应用来采集微弱的生物电信号，但事实上，对不同的样本，不 同类型信号的测量，有非常多的决定成败的细节。这就要求 授课教师不能仅仅依赖教材和论文，而要亲身实地尽可能多 地涉猎不同类型的实验，才不至于在授课中由于自己的“想当 然”而误导学生。如膜片钳的主要测量模式为贴附式、全细胞 模式、细胞膜内向外模式、细胞膜外向外模式。曾经很多老师 会认为，其中的贴附式是获得数据最简单、技术含量最低的一 种，比全细胞模式要容易很多，因为全细胞模式记录是在贴附 式记录基础上，吸破细胞和电极接触部分的细胞膜形成的，换 句话说进行全细胞模式记录之前先要形成贴附式封接。然而 事实并非如此。在膜片钳实验中，一般要求玻璃电极和细胞 之间实现高阻抗封接也就是通常说的 G 欧封接。对于全细胞 模式的记录来讲，由于信号较大，全细胞电流一般在数百 pA 到数千 pA，因此达到大约 1G 欧姆左右的封接，信噪比就足以 准确的测定实验信号。所以虽然全细胞模式比贴附式要多一 次将封接点细胞膜吸破的工序，但一般而言 50%以上的细胞 在吸破之后仍然可以保持 G 欧封接，可以获得有效的数据。 而反观贴附式记录模式，一般要测定的是被封接区域上的单 通道电流，多在 10pA 以下，这就需要封接电阻至少要达到 10G 以上才可以记录到单通道电流。而可以达到 10G 以上封接的 细胞并不特别常见，并且并不是每一次都可以准确地将离子 通道封在电极中。因此一般而言，可以说贴附式记录获得实 验数据的难度要大于全细胞模式。再比如常见的动作电位的 记录。膜片钳教科书上所给出的记录模式图均取自最初的双 电极电压钳细胞内记录，即在一根电极处给出短促的方波电 压刺激，在另一处电极处处于静息状态下记录细胞的动作电
膜片钳技术
膜片钳技术膜片钳技术80年代初发展起来的膜片钳技术(patch clamp technique)为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。
该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解，而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新，同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。
本文拟对膜片钳的基本原理及在心血管研究中的应用作一综述。
1膜片钳技术基本原理与特点膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴，两者的区别关键在于：①膜电位固定的方法不同；②电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。
电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。
因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。
目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。
该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极，对细胞损伤很大，在小细胞如中枢神经元，就难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳问题解答
膜片钳常见问题解答1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射），抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。
由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。
膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离(怎么分离)，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。
从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。
随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。
2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S），旧称姆欧，即安培/伏特。
常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12 S，1,000 pS＝1 pA/mV。
3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么区别?答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。
后者的灵活度大，因此多采用。
目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Raw output了。
若你想记录两个输出，则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。
4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。
膜片钳重点技术原理与基本操作
膜片钳技术原理与基本操作1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道旳离子电流来反映细胞膜上单一旳或多数旳离子通道分子活动旳技术。
1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验措施和电子线路进行了改善，形成了当今广泛应用旳膜片钳实验技术。
该技术可应用于许多细胞系旳研究，也是目前唯一可记录一种蛋白分子电活动旳措施，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大旳迈进动力，这一伟大旳奉献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。
一、膜片钳技术旳基本原理用一种尖端直径在1.5~3.0μm 旳玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上旳阻抗封接，此时电极尖端下旳细胞膜社区域（膜片，patch）与其周边在电学上分隔，在此基本上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上旳离子通道旳离子电流进行监测及记录。
基本旳仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。
膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录旳核心设备，具有高敏捷度、高增益、低噪音及高输入阻抗。
膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制旳同步记录离子流经通道所产生旳电流。
膜片钳放大器旳核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成旳电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定旳水平上。
二、操作环节1.膜片钳微电极制作(1) 玻璃毛细管旳选择：有二种玻璃类型，一是软质旳苏打玻璃，另一是硬质旳硼硅酸盐玻璃。
软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可减少电极旳串联电阻，对膜片钳旳全细胞记录模式很有利；硬质玻璃旳噪声低，在单通道记录时多选用。
玻璃毛细管旳直径应符合电极支架旳规格，一般外部直径在1.1~1.2mm。
膜片钳常见问题解答讲解
膜片钳常见问题解答（一）1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。
由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。
膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。
从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。
随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。
2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S），旧称姆欧，即安培/伏特。
常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12 S，1,000 pS＝1 pA/mV。
3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的 ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么区别?答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。
后者的灵活度大，因此多采用。
目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Raw output了。
若你想记录两个输出，则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。
4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。
模具钳工技能问答
模具钳工技能问答1、空冷钢焊接有哪些注意事项？答：（1）焊前彻底清理被焊部位表面（2）选择正确焊接材料（3）焊前选择正确预热温度，焊后敲击去应力，焊后缓冷。
2、描述空冷钢焊后出现裂纹的机理答：因为空冷钢具有高淬透性，焊接过程中一旦停止焊接，焊接处迅速冷却，焊缝金属和热影响区部位就会硬化，硬化组织产生应力，导致产生冷裂纹的敏感性增大。
3、定位基准的定义是什么？答：定位基准是指加工过程中，使工件在夹具中（或机床上）占有准确加工位置所依据的基准。
4、划线基准选择有哪三种基本类型？答：（1）以两个相互垂直的平面（或直线）为基准；（2）以两条相互垂直的中心线为基准；（3）以一个平面和一条中心线为基准。
5、冲裁过程中模具的失效模式有哪几种？答：冲裁过程中，模具常见的失效形式有刃口磨损和崩刃两种，过小的间隙对模具寿命不利，而大的间隙由于凸模侧刃面与材料的摩擦力降低，减小了磨损从而提高了模具的寿命。
6、冲裁件的正常断面由哪几部分组成？模具间隙大小对断面质量有什么影响？答：冲裁件正常的断面由塌角、光面、毛刺、毛面四部分组成，影响：模具间隙合适时光面约占1/2—1/3，塌角、毛刺均很小，间隙过小形成第二次光面，毛刺较长，间隙过大光面减小，塌角与毛面斜度增大，毛刺长。
7、编制零件机械加工工艺规程大致有哪些步骤？答：大致有下列步骤：（1）零件图的工艺分析。
（2）确定毛坯。
（3）拟定工艺路线。
（4）确定各工序的机床、夹具、刀具、量具和辅助工具。
（5）确定加工余量，工序尺寸及公差。
（6）确定切削用量和工时定额。
（7）确定重要工序的检验方法。
（8）填写工艺文件。
8、钻孔的切削速度、进给量和背吃刀量如何定义？选择钻削用量的原则是什么？答：切削速度：钻孔时钻头直径上一点的线速度。
进给量：主轴每转一周，钻头对工具沿主轴线的相对移动量。
背吃刀量：已加工表面与待加工面之间的垂直距离。
选择原则：在允许的范围内，尽量先选择较大的进给量，当进给量受到表面粗糙度和钻头刚度的限制时载考虑较大的切削速度。
膜片钳——精选推荐
一．Paul Zhou:What unique features in dendritic cells make them the most potent antigen-presenting cells. And how to explore these features in vaccine design and development.答：⑴DCs的特点：DCs广泛分布于全身各脏器，成熟DCs形态特殊，细胞膜具有很强的伸缩能力；DCs的细胞表面标志较多，但缺乏特异性的表面标志. 未成熟的DCs具有很强的抗原摄取能力。
而成熟的DCs抗原摄取能力下降，处理和提呈抗原的能力提高。
成熟DCs的主要特征：细胞形态不规则，表面有许多膜样或树突样突起；细胞表面具有丰富的有助于抗原提呈的分子；在混合淋巴细胞反应中，既能激活MHC相同的自身反应型T细胞，也能激活MHC不同的同种反应型T细胞；能激活Naive T细胞增殖并建立初级免疫应答，并具有向局部淋巴细胞T细胞区迁移的能力；DCs激发T细胞增殖及抗原提呈能力是巨噬细胞和B细胞的100-1000倍，也是唯一可以激活静息T细胞的APC。
正是以上能力使得DCs成为抗原提呈能力最强的APC⑵DCs在疫苗开发中的应用DCs可以有效递呈来自凋亡细胞的抗原，刺激CTLs成熟，因此可以用于制备抗肿瘤的细胞疫苗、多肽疫苗、以及全肿瘤疫苗。
细胞DC疫苗包括凋亡肿瘤细胞致敏的DCs和坏死肿瘤细胞致敏的DCs；多肽DC疫苗则是用已知肿瘤相关抗原肽体外免疫DCs，DC，可诱导相应的特异免疫应答，而且通过修饰某些抗原肽锚位上的单个氨基酸还可以增强该抗原肽与MHC I类分子的亲和力，从而增强其诱导CTL反应的能力；另外，如果利用全肿瘤抗原替代已知抗原疫苗，可以避免鉴定肿瘤特异性抗原的困难，也无需知道患者的MHC类型，还可以降低疫苗的免疫原性。
制备全肿瘤型DC疫苗的方法包括有：DC与肿瘤细胞共培养、肿瘤细胞RNA转染DCs、肿瘤-DC融合细胞等等，其中肿瘤-DC融合细胞不但提供DC的抗原呈递功能，还能持续提供内源性肿瘤抗原以进入MHC I呈递途径。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。
由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。
膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。
从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。
随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。
2.离子通道电导的单位是什么？如何换算？答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S ），旧称姆欧，即安培/ 伏特。
常用皮西门子（pS）, 1pS= 10E-12 S , 1,000 pS = 1 pA/mV。
3.MultiClamp 700A 中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output 是否需要连接信号器的ANALOG IN 接口? scaled output , raw output 有什么区别?答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等）, scaled output 为定标输出,输出的信号经过了处理。
后者的灵活度大，因此多采用。
目前膜片钳放大器多设有scaled output ，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOG IN!接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Raw output 了。
若你想记录两个输出，则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。
4.在Clampex的Edit protocol/Wave 中，Step和ramp各有什么适用范围？答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。
而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去极化的情况下，通道很快失活，无法使用ramp,另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用ramp。
5.什么是ramp?有什么作用？答：与步阶（step ）不同，ramp在pCIamp软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流，称为“斜坡电压或电流”，可用于作通道I-V 曲线。
6.input resistance 是什么意思？如何测量？答：在电生理学中，“ input resistance ”指“输入膜电阻（Rin）”。
全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（一般为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin。
膜电阻（Rm与膜输入阻抗Rin的关系为：Rm= 4n r2 Rin , r为细胞半径。
7.在一次电压钳全细胞记录中，是否每次一定要做电容消除、串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？答：在电压钳实验中，如果需要给予细胞电刺激来改变细胞膜电位（如超极化或去极化），则会出现膜的被动反应，产生电容电流与电阻电流，此时，前者需要用电容补偿消除，后者需要用漏减功能消除。
全细胞记录中，串联电阻是必须要补偿的（至少要补偿80%），除非它很小而忽略不计。
液接电位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。
你可采用Clampex软件中的菜单Tools/ Junction PotentiaI 功能对其测算，然后决定是否需要校正。
8.Decay 是什么意思？和inactivation 有何区别?答：Decay是“衰减”之意，in activation 是“失活”之意，但在文献中经常混用，decay 也常常被说成失活，例如钙电流的衰减常被说成失活，这样用也没什么问题。
但实际上，两者细分的话还是有区别的。
可以将Inactivation 分为稳态失活与非稳态失活。
后者即Decay,是指在刺激因素（电位变化、施加药物等）持续存在下通道的失活，而稳态失活（Steady-state inactivation ）一般是指将膜电位钳制在不同的水平，然后观察通道的失活情况，做出失活曲线。
9.什么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？答：在离子通道的激活因素（去极化或超级化）结束时通道的关闭过程叫做去激活（Deactivation），所记录到的电流称为尾电流（Tail current ），主要反映通道的关闭特征。
延迟整流性K+离子通道以及一些不同类型的Ca2+离子通道，它们的尾电流均具有电压依赖性，关闭过程呈指数分布，可用指数方程拟合而获得通道关闭过程的时间常数。
尾电流的分析对研究电压门控性离子通道的激活、关闭、失活等动力学过程很有帮助。
如研究尾电流幅度与脉冲电压的关系、脉冲电压的不同持续时间或尾电流不同的钳制电压对尾电流幅度、衰减时间常数的影响等等。
通过这些研究可了解通道关闭过程中出现的不同关闭状态。
药物可影响通道的关闭过程，表现为尾电流的衰减过程变快或变缓慢。
10.如何理解steady state activation 中的steady state 的意义？答：“ steady state ”是“稳态”的意思。
一般通过给予细胞持续一定时间的一系列去极化（多为去极化）脉冲来激活离子通道，记录通道电流峰值，再计算岀电导G,作出G-V曲线，该曲线称为稳态激活曲线，也就是我们常说的激活曲线。
膜片钳常见问题解答（三）11.电极拉制程序中具体应该如何控制。
在参数设定的摸索中，是否需要每次都用显微镜检测，还是另有更易操作的方法.答：不同的拉制仪拉制参数的设置不尽相同，你需要阅读说明书，参数中主要是设定拉力（对于P-97 拉制仪，只需要设置Velocity ，可不用设定Pull ）与温度。
一般第一步拉制电极颈部，温度要比第二步高（对于P-97 拉制仪，温度的设定需要先测量RamPS），拉力不要过大，以保证颈部较短；第二步拉制尖端，一般要使温度低些，拉力大些。
一般都是通过显微镜查看电极尖端，这很简单，并不复杂！最好是抛光，这样就在抛光仪显微镜下查看。
注意抛光后的电极尖端开口会变小，故在拉制电极时，尖端开口要大些。
检查电极还有其它方法，如“气泡数法”，也可用放大器通过测量电阻来查看。
12.Rm = 4n r2Rin ?似乎Rin是一个用细胞大小标化的膜电阻，那为什么不用电容Cm 来标化而用这个什么4n r2 ?细胞形状各异，Cm是个公认的膜面积的指标，电流密度不就是用Cm标化的吗？盼回答，同时希望能将Rin的意义再多讲一点，谢谢答：（1）一定要注意不要拘泥于Rm和Rin这两个符号，文献中常混用，但实际上表示的大多是Rin。
通常我们所说的“膜电阻”是指“膜输入阻抗Rin”，但也有人用来指Rm （2）你可以用Cm来计算膜面积，实际上这也正是我们的做法，用来估算细胞大小，用于对通道电流幅度进行标化，但我们从来不用它计算膜电阻Rm（也称为“固有膜电阻”）。
Rm勺计算公式是数学理论上的，并没有多少应用的价值，我们很少发现有使用Rm勺（虽然符号用Rm 0（3）实际上，Rin 反映的当然就是膜电阻，它被称为膜输入阻抗（或膜输入电阻），也时常被称为“膜电阻”（这正是使人们产生混淆的原因！），是膜的被动反应参数之一。
所谓被动反应是指膜上离子通道没有开放时，膜所表现出的电缆特性。
膜的被动反应参数还包括膜电容、轴浆电阻等。
全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（多为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律可求出Rin 。
当大量离子通道开放时，膜对电流的阻力急剧降低，测试脉冲电压与通道电流之间不满足欧姆定律，无法测量Rin，也没有了测量的意义。
13.请教什么是Channel availability ？答：Chan nel availability 指在排除失活情况下，能够开放的某通道的多少，通过全细胞电流幅度的大小来反映。
例如，海马神经元Na通道的channel availability 可因乙酰胆碱M受体的激活而降低，表现为Na通道电流幅度的降低。
14.什么是window current ，我知道是激活曲线和失活曲线的重叠。
但是我有一个疑问，比如电压依赖的T型钙通道，书上说在win do nw current的时候有持续性的钙内流，但是T性钙通道不是有时间依赖性的失活吗？怎么会有不失活的电流呢？答：如果将通道的稳态激活曲线与失活曲线作在一个图上，则激活曲线与失活曲线之间交叉部分的电流就是window current ，在这个电压范围内，有一些通道并没有完全失活，仍能被打开，有一定的开放概率。
T性钙通道是有时间依赖性的失活，但还有很小的部分失活非常缓慢，此即window current ，它是一些快速失活通道的动力学特征。
对于T型钙通道，其window current维持了一个紧张性去极化，对动作电位的连续发放产生影响，当然，不同细胞中的T通道其作用不尽相同。
15.使用Clampex 8.0 记录配体门控离子通道电流，protocol 如何设置? 答：需要事先在Lab Bench 中设定好Channel 序号和Signal 名称。
在EditProtocol中选择Gap-free模式，采样频率可用5kHz,选好In put和Output。
先在Clampex中启动记录（Record），然后诱发电流，可用Time Tag作诱发标记。
膜片钳常见问题解答（四）16.电极内液中加入1mmol/L的EGTA和10mmol/L的EGTA有什么区别？答：EGTA一般用10 mM左右（1 mM太低），促进封接，鳌和内钙。
17.什么是漏电流，为什么要做Leak subtraction ？答：漏电流的概念比较混乱，可以指封接电流（封接时从封接处“漏掉”的电流），也可指放大器的系统偏差，还可指膜漏电流。
一般来讲，膜漏电流是细胞膜的被动反应电流，是非离子通道电流，因此在记录离子通道电流时要将它去除。
膜片钳放大器与采样分析软件都具有将其去除的漏减功能。
18.请问动作电位是否一定要有越过0的超射，我在一篇文献中看到作者将一个没有超射的电位变化也称为动作电位，我觉得不对，应该是阈下反应才对吧？但又不敢下结论，觉得国外文献不该出错。
答：一般生理情况下动作电位都含有超射，超射与Na离子（或Ca离子）的平衡电位有关。
但在具体实验中（或某些病理情况下），若细胞内外液的Na离子（或Ca离子）的浓度发生变化，则Na离子（或Ca离子）的平衡电位也随之变化，就可能不产生超射或超射值更大。
19.我想请教一下为什么我们用培养的大鼠海马神经元记录NMD电流，总是会出现电流的衰减，而且我们记录是选择的培养第10-14 天的大鼠，可是电流大小不等，具体在100-1500pA 间波动，这让我们很疑惑，注明一下，电极内液中我们用了CsCl 和ATP、GTP。