流式细胞仪检测细胞凋亡Annexin VPI双染色法

流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法

实验步骤

1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL 500~1000r/min离心5min，弃去培养液。

2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。

3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。

4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。

5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm 的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。