生理学实验设计

生

理

实

验

设

计

实验课题：筒箭毒对神经-肌肉接头处的兴奋传递的影响实验成员：星期五下午第四实验室第二组

筒箭毒对神经-肌肉接头处兴奋传递的影响

实验假设

筒箭毒能与乙酰胆碱竞争神经肌接头处的nm受体，使肌肉松弛。

实验原理与目的

神经肌肉接头处的兴奋传递过程有三个重要的环节：

一是钙离子促进神经轴突中的囊泡膜与接头前膜发生融合而破裂；

二是囊泡中的乙酰胆碱释放到神经肌肉接头间隙；

三是乙酰胆碱与接头后膜上的受体结合，引发终板电位。

乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）是一种重要的神经递质，是连接每个运动神经元和骨骼肌之间的信使。如果ACh的传递受阻，肌肉就不能收缩。箭毒是美印第安人在猎箭头部涂抹的一种毒药，它能够占用并阻塞ACh 受体的位置，能竞争性阻断ACh 的去极化作用致使神经递质不能影响肌肉。能与ACh 竞争神经肌接头处的nm胆碱能受体，但不激动受体，因而使骨骼肌松弛。抗胆碱酯酶药可拮抗其肌肉松弛作用，新斯的明是胆碱酯酶抑制剂，可通过抑制胆碱酯酶增减乙酰胆碱在肌接头间隙的浓度。故筒箭毒过量可用适量新斯的明解救。筒箭毒与乙酰胆碱竞争性结合乙酰胆碱受体，注射新斯的明后使突触间隙内的乙酰胆碱浓度升高而使竞争性增强，故乙酰胆碱与受体接触增多，从而使肌无力症状减弱。

本实验的目的是探索筒箭毒对神经--肌接头处兴奋传递的影响极其相关机制；观察筒箭毒的肌松作用，分析其作用点；了解新斯的明对抗筒箭毒的作用。

实验对象

大白鼠，体重250g以上

实验器材与药品

Powerlab 一套（主机，刺激器，张力换能器），手术器械一套，小动物人工呼吸机，气管插管，棉线，大头针，铁架台，注射器0.001g%筒箭毒碱，0.005g%新斯的明，25%乌拉坦，1.5%普鲁卡因，生理盐水

实验方法

1. 大鼠称重，麻醉；25%乌拉坦腹腔注射0.5ml/100g麻醉。然后仰卧固定于鼠手术床上，分离气管及颈外静脉，分别插入气管插管和静脉插管，准备好人工呼吸机。数分钟后翻正反射消失，即可进行实验；

2. 分离坐骨神经；在髋关节后，坐骨结节内凹陷处切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露一段坐骨神经，用浸有 1.5%普鲁卡因的棉线围绕坐骨神经打一个结，在坐骨神经干上做传导阻滞麻醉，排除下行干扰；

3. 分离腓神经；在外侧剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，分离腓神经，神经穿线备用；

4. 分离胫前肌；将大鼠两前肢固定在手术台（仰卧），从后置踝关节正前方向剪开小腿皮肤，剪断踝关节前部韧带，分离胫前肌肌腱，沿胫骨分离胫前肌（注意不要损伤血管），在踝部的胫前肌肌腱处扎线，与结扎线远端切断肌腱；

5. 安装并设定powerlab记录肌张力的chart设定文件；调定刺肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递的影响

6. 连接仪器；手术操作完成后，将胫前肌与powerlab的张力换能器向连接，腓神经处安放刺激电极。最适负荷设定为10g左右。稳定一段时间后，于给药前记录一段正常的肌肉收缩曲线；

7. 缓慢静脉注射0.001%筒箭毒碱0.1ml/100g,从仪器上观察肌肉收缩曲线的变化情况；

8. 待肌肉收缩曲线再次稳定或完全消失后，停止刺激，同时缓慢静脉注射0.005%新斯的明0.15ml/100g,观察肌肉收缩曲线的变化情况。

预期结果

注射筒箭毒后肌肉收缩曲线幅度变小甚至消失，即肌肉处于肌无力状态，注射新斯的明后肌肉收缩曲线又基本恢复正常，即肌肉恢复正常收缩状态；

结果分析

从神经传来的兴奋，通过神经-肌肉接头传递给肌纤维膜，是以化学递质乙酰胆碱为中介进行的，其全过程可分为：（1）接头前过程.（2）神经递质在间隙的扩散.（3）接头后过程。

如果是筒箭毒作用于突触前膜，即不能释放乙酰胆碱，那么无论是否有新斯的明，后膜中均无乙酰胆碱，所以在注射新斯的明后仍然是肌无力状态，即不会出现预期结果；

如果是筒箭毒作用于突触间隙，即与突触前膜释放的乙酰胆碱结合，抑制其发挥作用，那么无论是否有新斯的明，后膜中均无可发挥肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递的影响作用的乙酰胆碱，所以在注射新斯的明后仍然是肌无力状态，即不会出现预期结果；

而如果是筒箭毒作用于突触后膜，即与乙酰胆碱竞争性结合乙酰胆碱受体，注射新斯的明后使突触间隙内的乙酰胆碱浓度升高而使其竞争性增强，使乙酰胆碱与受体接触增多，从而使肌无力症状减弱，使肌肉收缩曲线幅度增强，即会出现预期结果；

综上所述，假设成立。

注意事项

1. 在静脉注射筒箭毒和新斯的明时推射速度不宜过快，以免引起动物呼吸麻痹而导致其死亡，影响实验结果；当其呼吸停止时立即进行人工呼吸；

2. 分离神经时只能用玻璃分针，不可用金属器械或手触摸；

3. 分离神经时切勿伤及神经干及其分支，避免过度牵拉和其他不良刺激。

实验流程图

相关资料

1 神经肌肉接头处的结构在神经末梢中含有大量直径约50nm 的囊泡,称为接头小泡，一个

囊泡内约含有1万个乙酰胆碱分子。骨骼肌的神经-肌肉接头是由接头前膜、接头间隙、接

头后膜（运动终板）三部分组成。接头前膜是运动神经末梢嵌入肌细胞膜的部位，因此，

接头前膜是神经轴突的细胞膜；接头后膜，又称终板膜，是与接头前膜相对应的肌细胞

膜。它较一般的细胞膜厚，并有规律地向细胞内凹陷，形成很多皱褶，增加与接头前膜的

接触，有利于兴奋的传递。在接头后膜上有与ACh 特异结合的N2型乙酰胆碱受体，它们

集中分布与皱褶开口处，是化学门控通道的一部分，属于阳离子通道耦联受体。在终板膜

表面还分布有胆碱酯酶，它可将ACh 分解为胆碱和乙酸；接头前膜与后膜之间并不直接接

触，而是被充满了细胞外液的接头间隙隔开，间隔约50nm ，其中尚含成分不明的基质。

2 神经肌肉接头处的兴奋传递过程

从神经传来的兴奋，通过神经-肌肉接头传递给肌纤维膜，是以化学递质乙酰胆碱为中介进

行的，其全过程可分为：（1）接头前过程.（2）神经递质在间隙的扩散.（3）接头后过

程。

2.1接头前过程 肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递的影响 2.1.1乙酰

胆碱的合成与贮存

这是神经-肌肉接头的兴奋传递的前提。乙酰胆碱在神经末梢中由胆碱和乙酰辅酶A 在胆碱

乙酰化酶的作用下合成的。乙酰辅酶A 主要来自神经末梢内的线粒体，胆碱则是靠膜上的

特殊载体转运到神经末梢内的，其中50%是释放入接头间隙中的乙酰胆碱水解产物，被再

摄取回来重复利用的。合成与摄取回来的乙酰胆碱，均以囊泡形式包装贮存，以备释放。

2.1.2乙酰胆碱的释放 Ca2+内流是诱发乙酰胆碱释放的必要环节。当动作电位到达神经末

梢时，接头前膜的去极化使电压门控Ca2+通道开放，大量Ca2+由胞外进入到突触前末梢

内，这些Ca2+不仅是一种电荷携带者，可抵消神经末梢内的负电位，而且本身就是一种信

使物质，可以触发囊泡中的乙酰胆碱以胞吐的形式释放到接头间隙中。一次动作电位引起