新药含量测定的方法学研究

一、含量测定药味的选择：

药味的指标成分的选择既要考虑到指标成分的性质，又要考虑到能否对新药的有效性、安全性、可控性进行评价及中医的君臣佐使的关系，还有考虑到目前现有分析技术等！选择合理的药味，合理的指标性成分，对于制定含量测定标准可以说已经成功了一半！因此，含量测定药味、指标性成分选择至关重要！选择时着重从以下几个方面进行：

(1)需考虑含测指标与新药的安全性、有效性的关系。首选新药的有效成分及毒性成分为含测指标。如含有罂粟壳的止咳药中药，应测定吗啡的含量，并确定合理的含量限度范围。

(2)需考虑含测指标成分的理化性质。当新药中所含有效成分或毒性成分，因缺乏标准品、或因其他成分的干扰而确实难以建立含测方法时，可考虑选择与有效成分化学结构相似、理化性质相近的指标成分，或大类成份为含测指标，以间接反映新药的有效性或安全性。

(3)需考虑新药稳定性研究的需要。稳定性研究需要反映新药稳定性的灵敏指标。如含有苷类成分的新药，如采用水解后苷元的含量为含测指标则难以反映在贮存期问苷类成分水解成苷元的情况。新药中有几个有效成分都可测定含量时，需选择稳定性较差的成分，以反映药物的稳定性。

(4)传统中药需考虑中医理论的指导作用。传统中药复方制剂为，以中医理论为指导，采用传统工艺制成、以传统功能主治表述的中药复方制剂。其含测指标应考虑君臣佐使的配伍理论，首选君药的成分为含测指标。

(5)需考虑含测指标成分与工艺的关系。如含何首乌的复方，以其水提工艺制成的制剂中大黄素的含量很低，而用四羟基二苯乙烯苷为含测指标较好。

(6)需考虑中药多成分多靶点的特点。处方中含有多个明确有效成分的，或者处方中药味分别按不同路线提取的，建议研究建立多个含测指标；鼓励将有效成分、大类成分、浸出物等指标结合起来，以更全面控制产品质量。

(7)中药含量测定指标的选择需要考虑与基础研究的关联，体现基础研究与应用研究的关系。应充分利用已有的基础研究成果，为新药的研究和评价提供参考；同时，应结合新药应用研究的需要进行必要的基础研究，以提高中药质量控制的水平。已有的研究成果、文献资料是药品质量控制研究的基础，应加以充分利用，体现研究的继承性。如板蓝根一直缺少合适的含测指标，现发现其所含喹唑酮成分具有抗病毒活性，且溶于水及乙醇，含量稳定，有代表性，适用于作为板蓝根的质控指标。

(8)其他。含量限度过低者(如低于万分之一)，应增加含量测定指标或浸出物测定。在建立化学成分的含量测定有困难时，也可考虑建立生物测定等其它方法。中西药合用的复方制剂，需建立中药及每个化学药的含测方法。

二、含量测定方法介绍：

1. 测定方法：含量测定的方法主要有薄层扫描法；紫外分光光度法；高效液相色谱等。目前主要是使用高效液相色谱法（HPLC）进行，下面将做详细介绍高效液相色谱法的应用。

2. 高效液相色谱法简介：

2.1 色谱柱：最常用的填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基键合硅胶最为常用，即C18，其他还有C8柱，氰基柱,氨基柱等，正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。

2.2 检测器：最常用的检测器为紫外检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、示差检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器。

2.3 流动相：可采用固定比例（等度洗脱）或按规定程序改变比例（梯度洗脱）的溶剂组成作为流动相系统。

三、方法学考察：

现已***片为例，进行方法学研究。在***片中选择其君药中所含的A成分作为指标性成分进行含量测定的方法学研究。

3.1 检测波长的选择：取A对照品溶液，在200～700nm波长进行光谱扫描，发现光谱图在530nm波长处有最大吸收，故测定波长选定为530nm。

说明：一般选择待测样品化合物吸收度最大，即吸收曲线最高点为测定波长。化合物的最大吸收峰λmax或该化合物经显色后的最大吸收峰，通过分光光度计进行扫描后确定或通过二极管阵列检测来确定，并与该化合物文献值相比较应一致。在最大吸收峰处测定时灵敏度高，误差小。因此一般情况下选择最大吸收波长作为检测波长。

3.2 样品提取方法、溶剂考察：

取***片0.5克，精密加入不同溶剂25ml进行超声提取30分钟，进行含量测定，计算目标成分的含量。结果见下表：

以上结果表明，70%醇提取和乙醇提取含量最高，而二者含量又无明显差异，故确定提取溶剂为70%乙醇。

考察方法：根据指标性成分的性质选用易提取的几种溶剂进行提取对比试验，选择提取率高的一种溶剂作为提取溶剂。

3.3 提取时间考察：取***片0.5克，精密加入70%乙醇进行超声提取5、10、15、20、30分钟，进行含量测定，计算目标成分的含量。结果见下表：

以上结果表明，超声处理15分钟，含量不再增加，为了保证提取完全，故确定超声处理时间为20分钟。

考察目的：主要是选择把目标成分完全提取出来，所需的最短的时间，以便制定合理的分析方法。

3.4 标准品纯度考察：对照品纯度要求达到98％以上。对照品纯度一般都能够达到要求。

3.5 标准曲线制作：配制不同浓度的A对照品溶液，考察线进样量与峰面积的性关系、线性范围、相关系数等。

以进样量为横坐标峰面积为纵坐标做标准曲线：

以上结果表明，在0.0114～0.0569μg范围内，本品峰面积值与进样量有良好的线性关系。

说明：做标准曲线的目主要是（1）确定样品进样量与峰面积是否呈线性关系；（2）、确定线性范围，即适用的样品进样量的确定；（3）、标准曲线是否通过原点，通过原点时，

选用一种浓度的标准品称一点法，进行含量测定；不通过原点时，选用两种浓度的标准品（称两点法）进行含量测定。

3.6 阴性试验：要求样品溶液在与对照品液相同位置有相同保留时间的色谱峰，而阴性则无，主要是考察方法的专属性。常用阴阳对照法，即含以被测成分的药材样品与除去该成分的药材的样品作对照，可考察被测成分的位置是否与干扰组分重迭，以确证测定指标是否仅为被测成分的响应，防止假阳性的误判。

3.7 稳定性试验：考察不同时间点是否对测定方法和测定结果有影响，用同一被测样品的供试液在不同间隔时间用同一测定方法所得到的测定结果。一般考察36小时，计算RS D%不得大于3％。对照和样品均要做.

稳定性试验

试验结果表明，样品供试液和对照品溶液在24小时内稳定性良好

3.8 精密度试验：是指用相同方法对同一样品溶液进行多次测定，考察各测定值彼此接近的程度。具体如下：取同一样品，连续测定五次，相对标准偏差RSD％不得大于3％。对照和样品均要做，具体如下：

精密度试验

试验表明，仪器精密度良好。