基因工程载体(质粒-3章)
基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
第3章 基因工程-【必背知识】高二生物章节知识清单(人教版选择性必修3)(教师版)
新人教版生物学选择性必修3《生物技术与工程》知识梳理第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
一、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。
①使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。
(1)EcoR①限制酶切割EcoR①识别序列为GAATTCEcoR①切割部位为GA之间的磷酸二酯键(2)Sma①限制酶切割Sma①识别序列为CCCGGGSma①切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。
2.种类E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3．比较与名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
第三章 第一节 基因工程（基因表达载体的构建）
4．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列 操作与实验目的不符的是（ C ）
A．用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
三、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1．检测与鉴定的内容、方法
阅读教材98~99页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺 少的内容。
检测水平
分子水 DNA 平的检 RNA
测 蛋白质 个体水平的检测
检测内容
方法
结果显示
1．检测与鉴定的内容、方法
检测水平
检测内容
方法
结果显示
检测转基因生物的染色体 DNA分子杂交法（基因探针
3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全 能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但 又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有 多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质 时比大肠杆菌有优势。 有内质网和高尔基体
2．病毒感染法 用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞， 也能使目的基因导入动物细胞内。
（三）将目的基因导入微生物细胞 1．感受态细胞 经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会
发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为 感受态细胞。
2．过程
Ca2+处理微生物细胞
感受态细胞
质粒的分子生物学与质粒载体
质粒的分⼦⽣物学与质粒载体第三章质粒的分⼦⽣物学与质粒载体⼀、填空题1．基因⼯程中有3种主要类型的载体：——-------、------------⼀、-----------.2.由于不同构型的DNA插⼊EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度—----------—，OC DNA泳动速度—---------—，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染⾊的⽅法可将不同构型的DNA分别开来。
3.质粒的复制像染⾊体的复制⼀样，是从特定的起始点区开始的。
然⽽，质粒的复制可以是—---—向的、或是—----—向的。
在杂种质粒中，每个复制⼦的起点都可以有效地加以使⽤。
但是在正常条件下只有⼀个起点可能居⽀配地位。
并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下—------—的复制起点可能被苯闭。
4.就克隆⼀个基因(DNA⽚段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：—-----—、—---------—、—----------------—。
另外，⼀个理想的质粒载体必须具有低分⼦量。
5.如果两个质粒不能稳定地共存于同⼀个寄主细胞中，则属于—---------—群，这是因为它们的——————————所致。
6.质粒拷贝数是指细胞中—------------------------—。
7.复制⼦由三部分组成：(1)—-----------------—---(2)——-----------————(3)—--------------—。
8.酵母的2µm质粒有------------，可以配对形成哑铃结构。
9.⼀个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养⼀段时间后，⼀部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫----------------。
10.pBR322是⼀种改造型的质粒，它的复制⼦来源于----——，它的四环素抗性基因来⾃于—-----------—，它的氨苄青霉素抗性基因来⾃于—---------—。
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程：第三章 大肠杆菌基因工程
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
高效转录 O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控
lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物
存在时，整个操纵子处于基
底水平表达；诱导物可以使
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
高水平转录 阻遏蛋白
l噬菌体启动子PL / PR
受CI阻遏蛋白阻遏
阻遏作用
常采用温度敏感型突变cI857
cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，
Ptrp
PL便可介导目的基因的表达。但
在大型细菌培养罐中迅速升温非
常困难，因此常使用一个双质粒
控制系统，用色氨酸间接控制目
的基因表达。 Ptrp
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达水平高，遗传较稳定 优良的工业性能： 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统
一、大肠杆菌表达系统的优缺点 你有不足，但你仍是最爱——缺点
缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖 基化蛋白、结构复杂的蛋白等） 胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵 体），分泌机制不完善 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
组成型与诱导型启动子
基因工程载体(质粒-3章)幻灯片(1)
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。
如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以 迁移但属于非接合型质粒。
2）F 因子
F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子 (fertility factor)或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有 三种存在方式：①独立于染色体之外，闭环双链DNA形式 存在。这种细胞称F+细胞。②独立于染色体之外，闭环双 链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因 或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。③以线性DNA形式， 从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞 (高频重组细胞)。
如加入不同启动子序列，用于生产单链 DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加 入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片 段等等。
质粒载体的选择标记：
外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入 宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需 要利用质粒载体的可选择标记。
质粒载体的选择标记
抗生素抗性基因选择标记
蓝-白斑实验
构建的质粒人工载体，应用最广的是 PBR322，分子量为2.6×106，含46332bp。 含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr）基因来 自天然质粒RSF2124和抗四环素（Ter）基因 来自PSC101质粒。复制子部分来自PMB9 （一类Co1E1质粒）。多克隆限制性内节切 酶位点有9个
三四章分子克隆载体---题目_完_
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）一、名词解析二、填空题1.基因工程中有三种主要类型的载体、和。
2.就克隆一个基因来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分和、。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
3.如果两个质粒不能稳定的存在已同一个宿主细胞中，则属于群，这是因为他们的所致。
4.pBR 322是一种改造型质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来源于，它的氨苄青霉素抗性基因来源于。
5.Puc18质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。
它的复制子来源于，Amp抗性基因则是来源于。
6.当λ噬菌体DNA进入宿主细胞以后是靠宿主细胞的和形成封闭的环状的DNA分子的。
7.λ噬菌体是感染大肠杆菌的噬菌体。
8.α-互补是指 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的阴性的突变体之间实现互补。
9.溶源化的频率和与有关。
10.噬菌体DNA通过其上唯一的整合位点与宿主染色体DNA上的唯一整合位点发生重组，从而整合到染色体中。
11.通过分析大量缺陷型λ噬菌体的 DNA ，发现 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被或替换后，不影响λ噬菌体裂解生长。
12.对野生型大肠杆菌来说，向溶源和裂解方向的转变是由和决定的。
13.代表性λ噬菌体载体有和14.粘粒的组成包括________，________，________。
15.柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由________和_______cos尾巴构建的复合载体。
16.pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重组过程达到筛选目标克隆的目的。
该载体的复制起点来源于__________质粒，含_________和_________抗性基因。
17.酵母人工染色体由酵母染色体的__________、__________和__________等功能性DNA序列组成。
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
三、质粒与载体
1. 质粒概述 质粒（plasmid）：
一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传 因子，主要存在于各种微生物细胞中。
1.1 质粒的分子结构
通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；
也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒； 疏螺旋体、链霉菌和酵母菌
1.2 质粒的检测
其特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物， 通过它与目标RNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。
目标RNA是质粒DNA复制的引物或是用于编码复
制所需的Rep蛋白的mRNA。
属于这一复制调控类型的质粒包括ColE1、pT181、 p15A、pMB1、RSF1010、loDF13 、R1等ColE1质粒
RNA I antisense
5’ 3’
copB
copA tap
repA
oriV
3’ 5’
RNA II
RepA initiates replication
Tap
Repressor
Shine-Delgarno repA
重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation)
最常见于质粒如：F、P1、R6k 、RK2、RP4和pSC101等，是
• 耐碱性
与染色体DNA相比，质粒有较高的耐碱性，调pH至 12.4 ，可使染色体DNA变性，通过离心将其与质粒 分离
2. 质粒的复制和调节 2.1 质粒的大小
常见质粒大小的范围为1～200kb，个别大质粒可达800～1000 kb 质粒的大小常用分子量MD或碱基对数kb来表示。1MD的双链
DNA≈1.65kb。 未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个 标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。 最精确的测定需要对质粒DNA作序列分析，然后从所含碱基 数目来直接推算出其大小和分子量。
第三章 基因工程载体
表达载体与克隆载体的区别
Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体
pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能
4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体
3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
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四环素＋环丝氨酸选择
4. 显色法筛选重组子
通常用α互补现象的检查。很多质粒载体DNA都有一段(来自大肠杆 菌DNA)含β半乳糖苷酶基因(LacZ)的调控序列和该酶基因氨基端146个 氨基酸编码信息。并在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，并不破
坏阅读框。而宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒编
pUC 18 和pUC 19质粒图谱
质粒主要包括几个组成部分：
一、复制子（reilcator） 也就是基础复制子（basic replicon）， 具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制单 位。一般约2kb，含一个复制起始部位 Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有控制复 制的基因信息。
钝化了一个抗性基因，保留了另一个抗性基因。插入失活型载体，就是将 外源DNA片段插入到会导致选择性基因(Ampr，Tetr等)失活的位点。如
PACYC184质粒的EcoRI上插入外源DNA片段，会导致氯霉素抗生基因失活
(Cms)。也有例外，如Villa-Komaroff等1978年发现鼠胰岛素cDNA片段插 入PstI切点，并未使Ampr基因失活。
目前的载体主要有：
1,质粒（Plasmid）载体 2,入噬菌体 3,柯斯质粒（Cosmid） 4,M13噬菌体 5,杂交质粒 6,病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle ）。 7,细菌人工染色体.(bacterial artificial chromosome，Shizuya， 1992 BAC) 8,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，Merry，1983 YAC) 9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome PAC, loannon，1994）、 10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome， Farr，1991） 11,人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome， Harrington,1997） 12,植物人工染色体(PAC)
基 因 工 程 载体
概
述
基因工程是利用酶学方法将不同来源的
DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插入 到不同目的的基因工程载体中，进行扩增和表 达，研究基因结构和功能，基因和蛋白质关系 的一种分子生物学技术。
载体
基因工程的十分重要的工具。载体DNA分子 中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改 造后可插入外源的DNA，并可送入宿主细胞中， 使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增。
失去质粒后仍可正常生长繁殖。但质粒可以赋于寄
主某种新的有利的表型。
主复制，又是细菌复制非必须的。 ② 占总的基因组的1～3%。 ③ 所有原核生物都有质粒。 ④ 赋于细菌一种表型，是菌株特性不是菌种特性。
⑤ 隐蔽质粒(Cryptic plasmid)。
质 粒 载 体（Plasmid）
一词最早是由Lederberg，1952年提出的。是 双链、闭环DNA复制子（replicon）,存在于细菌的 细胞质中并独立于染色体之外,能自主复制的一类
DNA。 酵母的杀伤质粒（Killer Plasmid）是例外,
它是一种RNA复制子。根据导链霉菌中存在 线状 质粒 。质粒是细菌复制所非必须的，也就是说细菌
⑥ 质粒都是双链闭环DNA复制子，酵母的杀伤质粒例外(RNA)。
质粒的一般生物学性质
严紧型(Stringent plasmid)和松驰型(relaxed plasmid)质粒
1969年Rownd提出严紧型复制控制的质粒和松驰型控制的质粒。主
要指在标准的培养基生长条件下，每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数
复制起始位点(replication origin site)
是富 含A, T区,双链DNA在此 解鏈出现复制叉.
紧靠 富 A, T区的侧面富G,C区,组成回文结构,是
参与复制相关因子识别和结合位点.
具备有多克隆位点（Polylink）(MCS)
有数种限制性内切酶单一识别位点。便于 插入外源DNA片段，易组建重组质粒而不 影响质粒复制功能
多少划分的。严紧型质粒，一般分子量较高；每个寄主细胞中仅含10~60 个拷贝的质粒；松驰型质粒,每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数高,一种质
粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的。往往与寄主状况有关。质粒的复
制不仅受自身的制约，而且还受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白质合成的抑制
剂，一般在细菌生长的对数生长期后期(细菌达1×109细胞/mL)，加入氯
抗生素抗性基因选择标记
最常用，主要有：四环素(Tet)、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、卡 那霉素(Kan)、新霉素(Neo)等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成 Ampr，反之则写成Amps。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通
常有二种抗生素抗性基因，这样筛选质粒载体更可靠。外源DNA片段插入
迁移但属于非接合型质粒。
2）F 因子 F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子
(fertility factor)或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有
三种存在方式：①独立于染色体之外，闭环双链DNA形式 存在。这种细胞称F+细胞。②独立于染色体之外，闭环双 链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因 或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。③以线性DNA形式，
环形质粒分子
环形染色体DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
质粒DNA
控制质粒DNA转移的基因
质粒主要包括几个组成部分
复制子（reilcator） 复制起始位点(replication origin site) 多克隆位点（Polylink）(MCS) 辅助序列(COS位点等) 选择标记(LacZ,抗性等)
码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会 产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半 乳糖苷)后会形成蓝色菌落。而插入DNA的重组子则破坏了LacZ的阅读 框，不能使X-gal变蓝，而产生白色菌落。这种LacZ基因上缺失近操纵 基因区段的突变体(宿主菌)与带有完整的近操纵基因片段的β-半乳糖苷 酶阴性的突变体(质粒载体)之间实现互补，这种互补现象称为α互补。
2. 质粒的不相容性(incompatibility)
利用同一复制系统不同质粒不能稳定的和平共处的 生存，称为质粒的不相容性，有时又称不亲和性，是指 在没有选择压力情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒， 不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象。在细菌增殖 过程中，其中一种质粒必然会丢失。分子克隆技术正基 于质粒的不相容性质，在只带有一种质粒的细菌中，提 取单一的DNA。
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。 如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1 是一种可以
丢失四环素抗性标记的正选择体系
原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸
(fusaric acid)极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒
载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培
养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。
环丝氨酸富集法筛Tets重组子
四环素抗菌机理是抑制细菌蛋白质合成，使细菌停 止生长，但菌不死亡。环丝氨酸是氨基酸的类似物，在 细菌的生长过程中，如加入环丝氨酸，则会参入到细菌 新合成的蛋白质多肽链，使细菌死亡。所以在含有四环
这样通过明显的颜色变化，挑选重组子则变得简单易行。往往在这过程
中还要加入IPTG(异丙基硫化-β-D-半乳糖苷)作为酶反应催化剂。
质粒DNA有一段（来自大肠杆菌DNA）含β半乳糖苷 酶基因（Lac Z）的调控序列和该酶基因氨基端146 个氨基酸编码信息。在这个编码区中加入一个多克隆 酶切位点，不破坏阅读框。宿主菌有编码半乳糖苷酶 C端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不 完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产 生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X—gal后会形 成蓝色菌落。而插入 DNA的重组子则破坏了Lac Z 的阅读框，不能使X—gal变兰，而产生白色菌落。这 种突变体（宿主菌）与质粒载体之间互补现象称为α 互补。入IPTG作为酶反应催化剂。
霉素或壮观霉素，细菌染色体和严紧型质粒复制停止，而松驰型质粒经
过10~12小时，每个细胞中可多达几百个，甚至几千个质粒。每个细胞中 可达50%以上DNA是质粒DNA。
PUC质粒都属松驰型质粒。 PACYC184等质粒属严紧型质粒。 根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如果 插入外源DNA较大,或其产量过高会产生对 宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常选用严 紧型质粒。反之选用松驰型质粒。
常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有： 四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉 素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo） 等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成 AmPr，反之则写成AmPs，。带有抗药性质粒 称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素 抗性基因
新的质粒还带有下列标记基因，使于筛选重 组体： ①HA ②Luaferase ③GFP ④便于检测的多肽
素培养基上，环丝氨酸只杀死Tetr 细菌。对停止生长的