聚合酶链式反应ppt课件
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27
③引物的碱基序列
3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。
primer
3’GCTAGCTACTTAAG5’ 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’
template
3
4.1 PCR技术简史
1988年Saiki 等从水生嗜热杆菌中提 取到一种耐热-Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶的应用使得PCR能 高效率的进行，PE-Cetus公司推出 了第一台PCR自动化热循环仪。
1993年，Mullis因此项技术获诺贝 尔化学奖
4
5
94℃
55℃
72℃
TGCATGCAT 3’
引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG 模板
3’ ACGTACGTA 5’ 引物
ACGTACGTA 5’ 12
（3）DNA链的延伸 72oC
DNA聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链。
模板 5’ຫໍສະໝຸດ BaiduATCTTGAAC
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
合成超过600bp长度的DNA就有可能出现 错配，用于克隆基因时必须测序。
24
④ Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.70.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是 2.0mmol/L。
50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。
17
温度循环 95oC 5min
第二步——第三步——第四步
94oC 1min
72oC 2min
50oC 1min
复性
延伸
变性
18
19
4.4 PCR的特点
（1）特异性强
① PCR使用专门合成的DNA引物。 ② 延伸过程是在高温下进行。 这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延 伸形成的DNA。提高了反映的特异性。 （2）敏感性高
21
4.5 标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至
10ul 各200umol/L 10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L 100ul
22
4.6 影响 PCR的因素
（1）Taq DNA聚合酶 自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合 酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断 （37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。
50-60 oC下1分钟，引物与模板复性。
① 引物的浓度高， ② 引物的链短。
16
（3）第三步 延伸（extend） 72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶 在引物的3‘端上加上核苷酸。
（4）第四步 变性（denature）
94 oC下1分钟，新合成的DNA双 链又变性成单链模板。 （5）第五步 重复（repeat）
① 热稳定性 Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高 温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。
23
② 最适温度高 最适温度： 72-78 oC 延伸速度： 约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb
③ Taq酶的功能缺点
具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活 性，但没有3‘5’外切酶活性。
第四章 聚合酶链式反应
聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期发展起来 的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏 感、产率高、 快速、 简便、重复性好、 易自动化等突出优点。
1
4.1 PCR技术简史
1971年，Khorana提出： DNA经过 变性，与合适引物杂交，用DNA聚 合酶延伸引物，并不断重复该过 程便可克隆tRNA基因。
PCR循环
6
7
PCR仪
8
PCR反应
9
4.2 PCR反应原理
模板DNA变性
引物DNA复性 PCR
引物DNA延伸
10
（1）DNA模板变性 95oC
双链DNA在受热后，配对碱基的氢键 断裂，DNA两条链分开成为单链。
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
95oC
TGCATGCAT3’ ACGTACGTA5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
13
（5）1个循环的结果
（4）新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
14
PCR反应曲线
15
4.3 PCR的过程 （1）第一步 变性（denature） 94-95 oC下5分钟，模板DNA双链 完全变性成单链。 （2）第二步 复性（anneal）
25
（2）引物（primer) ①位置 与待扩增的模板DNA区段的两3’端 序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。
3’ 3’
26
②引物的长度
理论计算：
419=2.751011。
即2.751011 bp的基因组中有一次 完全与19个核苷酸的序列相同的 机会（或机会是约2×10-11）。
一般引物设计为长15—30bp。
但由于测序和引物合成的困难， 以及70年代基因工程技术的发明 使克隆基因成为可能，所以， Khorana的设想被人们遗忘了…
2
4.1 PCR技术简史
1985年，美国PE-Cetus公司Mullis等 人发明了聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的 DNA复制
最 初 采 用 E-coli DNA 聚 合 酶 I 的 Klenow片段进行PCR，
5’ ATCTTGAAC 模板 TGCATGCAT 3’
3’ TAGAACTTG
ACGTACGTA 5’
模板（template）
11
（2）DNA模板与引物复性 40-65oC 引物（primer）:
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与
所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
模板 5’ ATCTTGAAC
需要的模板量极低。
理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！
20
（3）快速 整个PCR过程约4小时即可完成。
（4）简便 对模板的纯度要求低。
不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定 或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。
（5）可以扩增mRNA RT-PCR：
先用逆转录酶将mRNA合成cDNA， 再以cDNA为模板进行扩增。
③引物的碱基序列
3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。
primer
3’GCTAGCTACTTAAG5’ 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’
template
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4.1 PCR技术简史
1988年Saiki 等从水生嗜热杆菌中提 取到一种耐热-Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶的应用使得PCR能 高效率的进行，PE-Cetus公司推出 了第一台PCR自动化热循环仪。
1993年，Mullis因此项技术获诺贝 尔化学奖
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94℃
55℃
72℃
TGCATGCAT 3’
引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG 模板
3’ ACGTACGTA 5’ 引物
ACGTACGTA 5’ 12
（3）DNA链的延伸 72oC
DNA聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链。
模板 5’ຫໍສະໝຸດ BaiduATCTTGAAC
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
合成超过600bp长度的DNA就有可能出现 错配，用于克隆基因时必须测序。
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④ Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.70.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是 2.0mmol/L。
50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。
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温度循环 95oC 5min
第二步——第三步——第四步
94oC 1min
72oC 2min
50oC 1min
复性
延伸
变性
18
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4.4 PCR的特点
（1）特异性强
① PCR使用专门合成的DNA引物。 ② 延伸过程是在高温下进行。 这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延 伸形成的DNA。提高了反映的特异性。 （2）敏感性高
21
4.5 标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至
10ul 各200umol/L 10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L 100ul
22
4.6 影响 PCR的因素
（1）Taq DNA聚合酶 自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合 酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断 （37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。
50-60 oC下1分钟，引物与模板复性。
① 引物的浓度高， ② 引物的链短。
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（3）第三步 延伸（extend） 72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶 在引物的3‘端上加上核苷酸。
（4）第四步 变性（denature）
94 oC下1分钟，新合成的DNA双 链又变性成单链模板。 （5）第五步 重复（repeat）
① 热稳定性 Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高 温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。
23
② 最适温度高 最适温度： 72-78 oC 延伸速度： 约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb
③ Taq酶的功能缺点
具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活 性，但没有3‘5’外切酶活性。
第四章 聚合酶链式反应
聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期发展起来 的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏 感、产率高、 快速、 简便、重复性好、 易自动化等突出优点。
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4.1 PCR技术简史
1971年，Khorana提出： DNA经过 变性，与合适引物杂交，用DNA聚 合酶延伸引物，并不断重复该过 程便可克隆tRNA基因。
PCR循环
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PCR仪
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PCR反应
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4.2 PCR反应原理
模板DNA变性
引物DNA复性 PCR
引物DNA延伸
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（1）DNA模板变性 95oC
双链DNA在受热后，配对碱基的氢键 断裂，DNA两条链分开成为单链。
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
95oC
TGCATGCAT3’ ACGTACGTA5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
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（5）1个循环的结果
（4）新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
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PCR反应曲线
15
4.3 PCR的过程 （1）第一步 变性（denature） 94-95 oC下5分钟，模板DNA双链 完全变性成单链。 （2）第二步 复性（anneal）
25
（2）引物（primer) ①位置 与待扩增的模板DNA区段的两3’端 序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。
3’ 3’
26
②引物的长度
理论计算：
419=2.751011。
即2.751011 bp的基因组中有一次 完全与19个核苷酸的序列相同的 机会（或机会是约2×10-11）。
一般引物设计为长15—30bp。
但由于测序和引物合成的困难， 以及70年代基因工程技术的发明 使克隆基因成为可能，所以， Khorana的设想被人们遗忘了…
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4.1 PCR技术简史
1985年，美国PE-Cetus公司Mullis等 人发明了聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的 DNA复制
最 初 采 用 E-coli DNA 聚 合 酶 I 的 Klenow片段进行PCR，
5’ ATCTTGAAC 模板 TGCATGCAT 3’
3’ TAGAACTTG
ACGTACGTA 5’
模板（template）
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（2）DNA模板与引物复性 40-65oC 引物（primer）:
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与
所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
模板 5’ ATCTTGAAC
需要的模板量极低。
理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！
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（3）快速 整个PCR过程约4小时即可完成。
（4）简便 对模板的纯度要求低。
不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定 或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。
（5）可以扩增mRNA RT-PCR：
先用逆转录酶将mRNA合成cDNA， 再以cDNA为模板进行扩增。