微生物培养和鉴定实验报告

微生物的培养与鉴定实验报告

刘琳1131428 环境科学同组：陈氏秋张

一、实验目的

1．学习微生物（细菌）鉴定的原理和方法。

2．掌握微生物（细菌）的快速鉴定操作步骤与自动化分析技术。

3．利用所学知识，分析并掌握微生物（细菌）的鉴定思路。

4．强化生物学知识，提高学生动手操作能力。

二、实验原理

细菌鉴定是细菌分类学中最实用的部分，与工、农业生产及人类生活有着密切的联系。在动、植物检疫，食品卫生检验，人类及动、植物病原诊断，环境微生物学研究等领域均需要细菌鉴定方面的工作。

细菌的鉴定是确定一个新的分离物是否属于一个已被命名的分类单元的过程。主要包括分离培养、显微镜观察、生理生化试验、血清学检验和动、植物接种等环节或技术。此外，还有噬菌体敏感性及抗生素敏感性试验等。

细菌鉴定首先要有一个分类系统做基础。根据这个分类系统，找出各分类单元间相互区分的一系列特征，构成一个鉴定系统，即细菌鉴定的检索表。换言之，检索表由一系列有关细菌特征的问题构成，这些问题引导人们通过一个分类系统来确定一个菌株的分类地位。检索表有双歧式和表格式两种形式。本实验采用表格式检索表。

表格式检索表(鉴定特征表) 只对分类群的特征进行总结。而不给分类特征以等级化的排列。表格式检索表往往包含较多的性状特征，因而看起来比双歧式复杂。但比双歧式优越。表格中记为“﹢”的结果是该分类单元中90％以上的成员为阳性的特征。因此，允许被鉴定对象的个别特征不确定。

三、实验材料

器材：ID32E接种条、6cm培养皿、接种环、火焰灯、接种台、恒温培养箱、ATB Expression仪、移液管、移液枪

药剂：生理盐水、培养18~24h的接种菌、石蜡油、James 指示剂

四、实验步骤

1．准备好ID32E接种条、6cm培养皿、接种环、火焰灯、移液管、移液枪、接种菌、石蜡油、生理盐水等用品，放到接种台上，并打开火焰灯。

2．用移液管移取5ml的生理盐水加入到6cm培养皿中。

3．把接种环放到火焰灯上烧红（保证细菌全部烧死），之后在旁边冷却，等温度降至100°左右时放入接种菌试管中的琼脂部分再冷却至常温，之后挑取接种菌，并放到培养皿中涂布均匀。

4．用移液枪移取培养皿中稀释的细菌液，然后滴在ID32E接种条上的32个孔中（每个孔55微升）。

5．在接种条上的0—6号滴一滴石蜡油，保证其孔成厌氧状态。

6．盖好接种条的盖子，放入37°恒温培养相中培养24小时。注意：要保持湿润。

7． 24小时后，取出ID32E接种条，在IND孔上加入James 指示剂，并在API 鉴定系统鉴定，打印出鉴定结果。

五、实验结果记录并整理

API鉴定系统鉴定ID32E接种条鉴定结果如下：

好的鉴定结果：

大肠埃希菌--------------------------------------可信度=98.3置信区间=0.26

克氏耶尔森菌------------------------------------可信度=0.7 置信区间=0.04

大肠埃希菌：不符实验数=3

克氏耶尔森菌：不符合实验数=4

六、实验结果讨论

由鉴定结果可以看出：所鉴定的细菌是大肠埃希菌的可信度为98.3%，是克氏耶尔森菌的可信度为0.7%。若是大肠埃希菌，则有3个实验不符合；若是克氏耶尔森菌则有4个实验不符合。从这里我们可以明显给出结论：我们所鉴定的细菌为大肠埃希菌。

由结果可以看出，虽然在IND 和SAC两个指标上因颜色不明显而无法判断，但并未对最终的结果判定产生很大影响。根据与伯杰细菌手册对比发现，SAC指标对于一个种的不同菌株会有不同反应，因此对于其准确度要求并不高。对于IND，手册中显示为阳性，但在本次试验中并未测定。可见该指标在鉴定系统中的重要性较低，并未必要性指标。在不符合试验的结果中发现，LDC、aGAL 和BGLU不符合概率分别达到了81%、99%和5%。LDC在结果中呈现阴性，在手册中表明应呈现阳性，所以，LDC的结果属于严重不符合的结果。aGAL 在结果中显示为阴性，而在手册中表明应呈现阳性或者反应迟缓及不规则阳性（突变型），鉴定系统认为即使出现突变，其几率很低，不可能出现如此大概率的阴性显性，所以也作为不符合的实验罗列出来。通过LDC和aGAL的判断对比可以发现，虽然两者在结果中同为阴性，而在手册中显示应为阳性，但是其不符合的概率并不相同。aGAL达到99%，远高于LDC的81%。这可以说明，虽然同为鉴定指标，但是aGAL的重要性高于LDC。并未在手册中找到BGLU的阴性阳性判断，因此无法作进一步判断。但是根据其在结果中的阳性结果以及其不可信概率来看，有可能是因为颜色不是很明显造成的判断依据不太充分。总体

来说，虽然此次实验结果中有2个试验指标并未检测出来，同时还有三个不符合实验，但是最最终结果鉴定并未产生很大影响。因此可以看出以上五个指标并非鉴定要求中的决定性指标，本次试验的结果可信度仍然很高。

通过克氏耶尔森菌与大肠埃希菌的对比发现，克氏耶尔森菌除了在LDC(赖氨酸脱羟酶)呈现与大肠埃希菌完全相反的结果，在其他指标上基本一致或者结果模糊（即在一个属中不同种得到不同反应），因此鉴定细菌有可能是克氏耶尔森菌，但概率很低。

实验过程中总是会出现一些误差，导致所得出的结果不是很理想，比如说操作误差，仪器误差，方法误差等。本实验可能存在以下误差：

1．操作台内空气中有细菌污染：操作台空间较大，火焰等灭菌范围有限，仅能保障火焰等附近区域呈现无菌状态。而在整个操作过程中，难免

有远离酒精灯的操作环节，可能会在这个过程中被其他细菌污染。

2．接种过程中的失误：接种时，可能会因为菌种选取的地方不同而导致菌种数量或者生长状态的不同。同时，由于接种环在接种前需在火焰

等上灼烧，有可能接种环的温度并未完全冷却的导致接种过程中出现

问题。

3．细菌液提取不均匀：接种时使用接种环在培养皿中进行混合，难免会导致提取细菌液时浓度不一致或者过低，这样会导致各项指标反应结

果有所偏差。

4．试剂盒内添加试剂的量不够或者添加试剂本身存在缺陷等。

5．API鉴定系统出现误差：自动化鉴定系统只能按照特定程序来进行编码和鉴定，可能会因为程序设置或者其他故障而导致鉴定结果出现一

定的偏差。

总体而言，对本次实验结果比较满意。如果需要进行进一步的试验计划，则应进行人工鉴定试验来确定不符合试验鉴定要求的指标是否是因人为或者仪器原因导致鉴定结果的偏差。