植物细胞膜透性的测定

实验四十五植物细胞质膜透性的测定

一、目的

植物细胞质膜是细胞与外界环境的一道分界面，对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。但植物常受到外界不良因子的影响，而不同植物种类其抗逆性则不同。用电导仪率法测定植物质膜透性的变化，可作为植物抗逆性的生理指标之一。本实验主要测定低温对细胞质膜透性的影响，并掌握用电导仪法测定植物细胞质膜透性的原理及方法。

二、原理

植物细胞的细胞质由一层质膜包围着，这种质膜具有选择透性的独特功能。植物细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。各种不良环境因素对细胞的影响往往首先作用于这层由类脂和蛋白质所构成的生物膜。如极端的温度、干旱、盐渍，重金属离子（如Cd2＋等）和大气污染物（如SO2、HF、O3）等都会使质膜受到不同程度的损伤，其表现往往为细胞膜透性增大，细胞内部分电解质外渗，外液电导率增大。该变化可用电导仪测定出来。细胞膜透性变得愈大，表示受害愈重，抗性愈弱，反之则抗性愈强。

三、材料、仪器设备

1. 材料：植物叶片。

2. 仪器设备：电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；5 0ml

烧杯；50ml量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。

四、实验步骤

1. 清洗用具

所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗，然后用自来水、蒸馏水洗3次，干燥后备用。

2. 实验材料的准备及处理

选取叶龄相似的植物叶片，剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗1～2次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后剪成约1c m2的小叶片（或用直径为1的打孔器钻取小园片），注意除掉大叶脉。将剪下的小叶片混合均匀，快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理：A杯放入冰箱0℃以下作低温处理，处理15～30min后取出（供试叶片也可以在实验前低温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定），加入蒸馏水50ml。

B杯常温处理，加入蒸馏水50ml。

将A、B二杯放入真空干燥器，用真空泵抽气20—30min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B杯。

C杯加入蒸馏水50ml，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸10～15min（煮沸时间依不同植物叶片而定），冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续浸泡叶片。

将A、B、C三杯放置室温下浸提1 h左右（经常摇动，以有利电解质外渗）。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。

3. 电导率测定

用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率，同时测定蒸馏水（空白）的电导率（注意：每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定），所测得的结果记入下表：

电导率测定记录表

处理电导率(μS · cm－1) 电解质的相对外渗率（％）

蒸馏水（空白）

A（低温）

B（常温）

C（煮沸）

五、结果计算

按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率：

处理电导率－空白电导率

电解质的相对外渗率（％）＝——————————————× 100

煮沸电导率－空白电导率

实验四十二植物体内丙二醛含量的测定

一、目的

通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。

二、原理

丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol· L－1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：植物叶片。

2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。

3. 试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。

四、实验步骤

1. 丙二醛的提取

称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。

2. 显色反应及测定

取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。

五、丙二醛含量计算：

由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10－3，M DA－TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。

按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。方程组：

A450=（85.4×10－3）·C糖

（A532－A600）=（155×10－3）·C MDA+（7.4×10－3）·C糖

解得：

A450

C糖= —————— = 11.71A450（mmol·L－1）

85.4×10－3

C MDA= 6.45（A532－A600）－0.56A450-（μmol·L－1）

公式中：A450—在450nm波长下测得的吸光度值

A532—在532nm波长下测得的吸光度值

A600—在600nm波长下测得的吸光度值

﹡—1.55×105为摩尔比吸收系数

C糖、C MDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。

1.按下式计算提取液中MDA浓度

反应液体积（ml）

C MDA ×—————————

1000

提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）= ———————————————

测定时提取液用量（ml）

2.按下式计算样品中MDA含量