硫代磷酸酯类有机磷药物抗原设计及免疫分析_王晶

种广谱型杀虫剂，广泛应用于植 物 病 、虫 、害 的 防 治 [1]，大 见表 1。
多数不溶于水，易溶于有机溶剂，遇碱分解，对氧 、光、热
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相对稳定。有机磷药物根据结构差异可分为硫代磷酸酯、 表 1 硫代磷酸酯类有机磷药物在农产品中的最大残留限量
磷酸酯、焦磷酸酯、磷酰胺酯和磷酸酯等，其中硫代磷酸酯 Table 1 Maximum residue limits of phosphorothioate 资
蒙特卡洛方法。分子模拟可以应用于免疫原设计分析中， 构，并将重组的抗体基因转入到原核或真核表达系统中进
根据抗原-抗体之间的识别作用，是基于分子的电子特性 行表达，就形成了重组抗体。首先，重组抗体不需要免疫动
所决定原子空间排列及其相互作用，假设化合物与偶联物 物。其次，重组抗体获得的菌株比杂交瘤细胞株稳定，容易
pesticide
药物种类
食品类别
最大残留限量 /mg·kg-1
食品种类
最大残留限量 /mg·kg-1
料
甲基对硫磷
谷物
杀螟硫磷
谷物
对硫磷
谷物
乐果
谷物
倍硫磷
谷物
辛硫磷
谷物
二嗪磷
谷物
马拉硫磷
谷物
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果蔬
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果蔬
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果蔬
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果蔬
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果蔬
图 4 类特异性半抗原的合成路线 Fig.4 Synthetic route of class specific hapten
图 7 半抗原 H1-H6 合成路线 Fig.7 The synthetic methods of haptens H1-H6
1.2.2 以硫代磷酸二乙酯类有机磷药物共同部分即硫代 1.3 分子模拟类特异性半抗原
图 6 二乙基磷酸乙酸结构式 Fig.6 The structure of diethylphosphonoacetic acid
1.2.4 以硫代磷酸酯类药物的共同结构— ——烷氧基硫代 磷 酸 铵 盐 为 原 料 ，通 过 和 卤 代 短 链 羧 酸 反 应 ，向 分 子 中 引 入活性基团羧基，设计了一系列半抗原，合成路线见图 7。 图中 H1：R=CH3，X=S；H2：R=CH3CH2，X=S；H3：R=CH3，X=S
量结构-活性关系（QSAR 方法）来研究抗体的识别能力 。 独辟蹊径。
从 QSAR 模型的基础上获得新的方法，对两种异源包被的 2.4 人工模拟抗体
半抗原，4-（二乙氧基硫代磷酰氨基） 丁酸 （半抗原 2）和
人 工 模 拟 抗 体 技 术 ，即 利 用 体 外 模 拟 的 方 法 ，制 备 筛
4-（二乙氧基硫代磷酰）-2-甲基苯甲酸（半抗原 3）进行了 选 出 合 适 的 抗 体 ， 包 括 指 数 富 集 的 配 基 系 统 进 化 技 术
设计与合成，使用半抗原 2 作为包被半抗原，在 8 种 O， （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,
H4：R =CH3CH2，X =S；H5：R =CH3，X =O；H6：R =CH3CH2， X=O。
文献中选择 H1、H2 为包被半抗原，H3-H6 为免疫半 抗 原 ，这 一 类 半 抗 原 与 具 有 磷 硫 双 键 的 半 抗 原 相 比 ，含 磷 氧双键的半抗原更易与载体蛋白偶联，共性结构中的烷氧 基团对偶联效果的影响相对较小，有利于抗原合成[11]。
收稿日期：2015- 11- 03 基金项目：农业部公益性行业（农业）科研专项（201203040） 作者简介：王 晶（1991-），女，在读硕士，主要从事食品安全检
测研究，E- mail：15038551637@163.com
硫代磷酸酯类有机磷药物常用的检测方法有色谱分 析法和免疫分析法。与前者相比，免疫分析法具有简单、快 速 和 灵 敏 的 优 点 ，因 此 近 年 来 发 展 迅 猛 ，国 内 外 关 于 有 机 磷药物残留检测的相关报道是屡见不鲜，应用于商业检测 的 试 剂 盒 也 有 数 十 种 之 多 [4]，现 在 正 逐 渐 发 展 成 为 一 种 相 对成熟的快速检测方法。而免疫分析法的关键在于半抗原 的 设 计 与 合 成 ，因 此 ，笔 者 等 拟 对 硫 代 磷 酸 酯 类 有 机 磷 药 物的半抗原设计及其免疫检测方法进行综述。 1 硫代磷酸酯类有机磷药物半抗原的合成与设计
Ｊ ＴＣＶＭ
2016 年 第 1 期
硫代磷酸酯类有机磷药物抗原设计及免疫分析
王 晶 1，陈秀金 1，王方雨 2，李道敏 1，李兆周 1，张改平 2，邓瑞广 2，侯玉泽 1
（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471023；2. 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室， 河南郑州 450002）
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2016 年 第 1 期
分子模拟技术是凭借合理的分子结构模型与物理原 2.3 基因工程抗体
理计算出客观事物变化的过程与结果。分子模拟技术主要
随着基因工程技术的不断发展，针对抗体基因结构的
有 4 种：量子力学方法、分子力学方法、分子动力学和分子 研究也越来越深入。应用基因重组技术改造抗体的基因结
类有机磷药物包括一硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯（结构见 organophosphorus pesticide in agricultural products
图 1a），一硫代磷酸酯又分为硫逐磷酸酯（结构见图 1b）和 硫赶磷酸酯（结构见图 1c）。
a
b
c
图 1 硫代磷酸酯类有机磷药物结构式
Fig.1 Structures of phosphorothioate organophosphorus
抗原决定簇部分的结构相似度越高，则该化合物与相应抗 保存。最重要的是，重组抗体的特异性和亲和性都比较高。
体之间的亲和力越高。可以通过比较偶联物相应区域与待 Li 等[17]利用经过甲胺磷偶联物超免的 BALB/c 小鼠脾细胞，
分析物的空间结构及电子构型来进行半抗原设计，并通过 克隆、组装并构建了甲胺磷的单链抗体库，然后通过噬菌
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果蔬Βιβλιοθήκη Baidu
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果蔬
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其中 R1、R2 多为甲氧基（CH3O-）或乙氧基（C2H5O-）； R3 为烷基、芳香基等。在农业生产中，常用的硫代磷酸酯 类 有 机 磷 药 物 有 甲 基 对 硫 磷 、杀 螟 硫 磷 、对 硫 磷 、乐 果 、倍 硫 磷 、辛 硫 磷 、二 嗪 磷 、马 拉 硫 磷 和 甲 拌 磷 等 [2]。 药 物 在 喷 洒时会通过消化道、皮肤、黏膜和呼吸道吸收，抑制生物体 内 胆 碱 脂 酶 的 活 性 ，引 起 运 动 失 调 、昏 迷 、呼 吸 中 枢 麻 痹 、 瘫痪甚至死亡。由于一部分农业种植者滥用或不合理使用 有 机 磷 药 物 ，造 成 农 产 品 中 药 物 残 留 严 重 超 标 ，导 致 中 毒 事件频繁发生，例如 2010 年 4 月青岛“毒韭菜”事件，因甲 拌磷残留超标造成 6 人中毒；2011 年 3 月河南省南 阳 市 又出现同类“毒韭菜”，因农残超标致 10 人中毒。因此，为 了 更 好 地 监 管 和 控 制 有 机 磷 药 物 的 残 留 ，国 家 标 准《食 品 中 农 药 最 大 残 留 限 量》（GB2763 - 2012）对 谷 物 和 果 蔬 中 硫
1.2 类特异性半抗原的合成与设计 目前，已有很多关于有机磷药物多残留免疫分析方法
的报道[8-11]，概括起来，包括以下几种途径： 1.2.1 以 O，O-二甲基硫代磷酰氯和 4-羟基苯甲酸甲酯 为 原 料 进 行 反 应 得 到 的 产 物 ，经 过 碱 水 解 ，得 到 半 抗 原 O ，O - 二 甲 基 - O -（4 - 羧 基 苯 基）硫 代 磷 酸 酯 [ 8 ] ，合 成 路 线 见图4。上述半抗原具备硫代磷酸酯类有机磷药物的共性 结构甲氧基（[ OHCH2）2PS-]，所以利用该半抗原制备了能 够识别多种有机磷药物的抗体，并建立了有机磷药物多残 留检测的免疫分析方法，但由该半抗原获得抗体的敏感度 尚未达到我国规定的最大残留限量水平。
图 2 甲基对硫磷半抗原的合成路线 Fig.2 Synthetic scheme of parathion-methyl hapten
1.1.2 以药物生产的中间体为反应物，经过多步反应得 到具有末端活性基团的半抗原。为了提高半抗原和药物的 结构相似度，在设计硫代磷酸酯类有机磷药物半抗原时有 时还会引入苯环，如 邓 浩 等 [7]合 成 了 对 硫 磷 半 抗 原 ，其 合 成路线见图 3。
摘 要：半抗原的设计与合成是免疫分析方法的关键。本文介绍了硫代磷酸酯类有机磷药物半抗原的设计
路线与合成方法，总结了各种免疫分析方法（如酶联免疫法、偏振荧光免疫法、胶体金免疫层析法和免疫传感器）
在硫代磷酸酯类有机磷药物残留检测中的应用，并对未来免疫分析法的发展方向进行了展望。
关键词：硫代磷酸酯类有机磷药物；半抗原设计；免疫分析；检测
磷酸二乙酯和芳香环为基础，设计了一系列不同手臂及取 代位置的半抗原（H1-H8）[9]，具 体 方 案 见 图 5。 图 中 H1： R ＝4 -COOH；H2：R ＝3 -COOH；H3：R ＝4 -CH =CH -COOH； H4：R ＝3 -CH =CH -COOH；H5：R ＝4 -NH -CO -CH2 -CH2 COOH；H6：R＝3-NH -CO-CH2-CH2-COOH；H7：R＝4-NH CO-CH=CH-COOH；H8：R＝3-NH-CO-CH=CH-COOH。图 5 中半抗原的结构和 7 种硫代磷酸酯类有机磷药物相似， 再 加 上 反 应 过 程 比 较 简 单 ，所 以 比 较 容 易 推 广 应 用 。 对 比 抗体的灵敏度发现，半抗原结构中取代位置在苯环的对位 时，所获 得 类 特 异 性 抗 体 的 灵 敏 度 较 高 [8]，其 原 因 可 能 是 手臂在苯环对位时，使硫代磷酸二乙酯结构暴露得更充 分，有利于刺激动物产生免疫应答。
主成分分析法来确定最佳半抗原，以获得高特异性的抗 体展示技术筛选到特异性识别甲胺磷的重组单链抗体。基
体。Xu 等[12]以 4-（二乙氧基硫代磷酰）苯甲酸为半抗原， 因工程抗体技术虽然没有单抗和多抗的应用那么广泛，但
用计算机辅助分子模型，模拟二维（2D）和三维（3D）的定 是利用其独特的新技术手段，必将为小分子药物残留检测
中图分类号：S482.3
文献标志码：A 文章编号：1000- 6354（2016）01- 0071- 07
DOI:10.13823/j.cnki.jtcvm.2016.01.030
有机磷药物 （Organophosphorus pesticide，简称 OP）一 代磷酸酯类有机磷药物最大残留限量进行了规定[3]，具体
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资 料
图 3 对硫磷半抗原合成路线 Fig.3 Synthetic route of parathion hapten
图 5 半抗原 H1-H8 的合成路线 Fig.5 Synthetic schemes of haptens H1-H8
1.2.3 选择二乙基磷酸乙酸为硫代磷酸酯类有机磷药物 的类特异性半抗原[10]，其化学结构见图 6。以二乙氧基磷 酸为共同结构设计和合成类特异性的半抗原时，以二乙氧 基磷酸基团作为抗原决定簇，制备的抗体对硫代磷酸酯类 有机磷药物具有相对较广泛的检测范围。
硫代磷酸酯类有机磷药物为小分子物质（Mw<1 000 Dal）， 因缺乏 T 细胞表位而无法直接诱导机体产生抗体，故必须 对其化学结构进行改造和修饰，以得到具有活性基团的结 构类似物，即相应的半抗原。而半抗原设计的成功与否直 接决定了硫代磷酸酯类有机磷药物抗体制备的成败。 1.1 种特异性半抗原的合成与设计
据报道，硫代磷酸酯类有机磷药物特异性半抗原的设 计与合成主要有两种途径。 1.1.1 以某些有机磷药物为反应物，将其分子中苯环上
2016 年 第 1 期
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的 硝 基（- NO2）在 锌 粉 的 作 用 下 还 原 成 氨 基（- NH2），得 到 相 应 的 半 抗 原 ，如 刘 长 武 等 [5] 报 道 了 甲 基 对 硫 磷 半 抗 原 的 合成过程，Ereegovich 等[6]以对硫磷药物作为原料，经还原 反应得到的半抗原合成路线，如图 2。