盐酸维拉帕米缓释片微生物限度检查方法学的建立

CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.8 No.9 May 2018

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2018年5月第8卷第9期

·药物研究·

盐酸维拉帕米缓释片微生物限度检查方法学的建立

余展旺 吴伟东 罗达敏 深圳技师学院应用生物系，广东深圳 518116

[摘要] 目的 建立盐酸维拉帕米缓释片微生物限度检查方法。 方法 按《中国药典》2015年版四部通则，采用中和剂硫氰酸铵（1g/100mL）+稀释法（1∶50）进行微生物计数法和控制菌检查法的方法学验证。 结果 对盐酸维拉帕米缓释片进行了3次验证，每次的菌种回收率在50%～200%范围内，控制菌的检查都符合2015版《中国药典》规定。 结论 中和法能有效去除盐酸维拉帕米缓释片的抑菌成分，不影响污染微生物的生长，适用于检查该制剂微生物限度和控制菌检查。

[关键词] 盐酸维拉帕米缓释片；微生物限度检查；中和法；稀释法

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2018）09-45-05

Establishment of methodology for microbial limit test of

Verapamil Hydrochloride Sustained-release Tablets

YU Zhanwang WU Weidong LUO Damin 

Department of Applied Biology, Shenzhen Technician College, Guangdong, Shenzhen 518116, China

[Abstract] Objective To Establish a microbial limit test for Verapamil Hydrochloride Sustained-release Tablets. Methods According to the four general rules of the 2015 edition of China Pharmacopoeia, the methods of microbial count and control bacteria examination were carried out by the neutralizer ammonium thiocyanate (1g/100mL) + dilution method (1:50). Results 3 tests were carried out on Verapamil Hydrochloride Sustained-release Tablets. The recovery rate of bacteria was within the range of 50% to 200%. The control bacteria were checked in accordance with the 2015 edition of China Pharmacopoeia.Conclusion The neutralization method can effectively remove the bacteriostasis components of Verapamil Hydrochloride Sustained-release Tablets, and does not affect the growth of contaminated microorganisms. It is suitable for checking the microbial limit of the preparation and controlling the bacteria check.

[Key words] Verapamil Hydrochloride Sustained-release Tablets; Microbial limit test; Neutralization method; Dilution method

盐酸维拉帕米缓释片用于原发性高血压，化学名称：α-[3-][2-（3，4-二甲氧苯基）乙基]甲氨基]丙基] -3，4-二甲氧基-α-异丙基苯乙腈盐酸盐。分子式：C 27H 38N 2O 4·HCl。盐酸维拉帕米为钙离子拮抗剂，钙离子拮抗剂又称钙通道阻滞剂（CCB），通过调节心肌传导细胞、心肌收缩细胞以及动脉血管平滑肌细胞细胞膜上的钙离子内流，发挥其药理学作用，但不改变血清钙浓度。该药是我国高血压患者最常使用的一类降压药[1] ，《中国药典》2015年版二部收载有该品种[2]。根据《中国药典》2015年版四部相关规定，盐酸维拉帕米缓释片应进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及大肠埃希菌的检查[3]。在建立药品的微生物限度检验方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合该产品的微生物限度检查，从而保证所建立检验方法的科学性和检验结果的准确性。本品微生物限度检查方法学的建立如下。

1 材料与方法1.1 试验仪器

生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），湿热灭菌柜（山东新华医疗器械股份有限公司），生物安全柜（山东博科生物产业有限公司），干热灭菌柜（山东新华医疗器械股份有限公司），电子天平 （赛多利斯科学仪器北京有限公司）；匀浆仪 （上海炳隆机电设备有限公司）。1.2 试药

盐酸维拉帕米缓释片（批号20151201、20151202、20151203），硫氰酸铵。 1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基；麦康凯液体培养基；胰酪大豆胨液体培养基；pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液；麦康凯琼脂培养基。1.4 验证用菌株

铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]； 金黄色葡

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萄球菌[CMCC（B）26003]；枯草芽孢杆 菌[CMCC （B）635011]；白色念珠菌[CMCC（B）98001]；黑曲霉[CMCC（B）98003]，中国食品药品检定研究院提供。

1.5 试验菌悬液的制备[2]

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5mL 含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

1.6 中和剂的制备

以硫氰酸铵（1g/100mL）作为中和剂，用pH 7.0缓冲液作为溶剂来溶解硫氰酸铵。采用过滤法除菌。

1.7 常规法菌落回收率试验

1.7.1 供试液的制备 称取供试品10g，置于研钵中研成细粉，转移至无菌三角瓶中，加入pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液400mL，置匀浆仪500转/min 匀浆5min，既得1∶40供试液。

1.7.2 供试品试验组 取上述供试液，分装为50mL/瓶，分装5瓶，在分配好的供试液中加入0.5mL浓度为103～104 cfu/mL的实验菌（实验菌分别为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌）混匀，制成试验组样品溶液。采用平皿法，取上述试验组样品溶液1mL加入无菌平皿中，每种试验菌平行制备2个平皿。其中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌倾注TSA，白色念珠菌及黑曲霉菌应同时倾注TSA 及SDA。

1.7.3 菌液对照组 取pH7.0缓冲液，分装至5个三角瓶中，每瓶50mL，加入目标稀释级103～104cfu/mL的菌液各0.5mL，混匀，作为菌液对照组。取1mL加入无菌平皿中，每种试验菌平行制备2个平皿。

1.7.4 供试品对照组 取供试品1mL加入无菌平皿中，倾注已融化的TSA及SDA，每种培养基平行制备2个平皿。

1.7.5 阴性对照组 取pH7.0缓冲液1mL加入无菌平皿中，倾注已融化的TSA及SDA，每种培养基平行制备2个平皿。

1.7.6 需氧菌于30～35℃培养≤3d，霉菌及酵

母菌于20～25℃培养≤5d。菌落回收率%=（试验组菌数-供试液对照组菌数）/菌液对照菌数×100%。

1.8 中和法菌落回收率试验

用不同类别的微生物考察供试液是否有抑菌性及检验程序的可靠性，将验证试验分成5组，并计算试验组和中和剂毒性组的菌回收率。

1.8.1 供试液制备 称取盐酸维拉帕米缓释片10g，置于无菌三角瓶中，加入含硫氰酸铵（1g/100mL）的pH 7.0缓冲液500mL充分混匀，让其反应完全，即得1∶50供试品溶液。

1.8.2 供试品试验组 取供试液100mL，分装5个三角瓶，每瓶20mL。在分装好供试液试的三角瓶中分别加入0.2mL的目标菌悬液（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，浓度为103～104cfu/mL）即得供试品试验组溶液。取上述溶液1mL加入无菌平皿中，每种试验菌平行制备2皿。其中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌倾注培养基TSA，白色念珠菌、黑曲霉分别倾注培养基TSA及SDA。

1.8.3 中和剂毒性组 取含硫氰酸铵（1g/100mL）的pH 7.0缓冲液100mL，分装5个无菌三角瓶中，每瓶20mL。在分装好的中和剂三角瓶中分别加入0.2mL的目标菌悬液即得中和剂组溶液。取上述溶液1mL加入无菌平皿中，倾注对应培养基，待凝固后倒置培养，每种试验菌平行制备2皿进行微生物回收试验。

1.8.4 菌液对照组，供试品对照组，阴性对照组：方法同常规法。

1.8.5 培养及计数 TSA平皿于30～35℃培养不超过3d；SDA平皿于20～25℃培养不超过5d。结果观察和计数逐日点计平板菌落数，并记录结果，以最终的时间计数为准。

1.9 控制菌检查

1.9.1 供试液增菌培养

1.9.1.1 供试品试验组 采用中和法制备供试液，取含有103～104cfu/mL的大肠埃希菌菌悬液0.5mL 分别加入含有50mL供试液的三角瓶中，摇匀。取10mL接种至100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h，必要时可延长至48h。

1.9.1.2 菌液对照组 取含有102～103cfu/mL的试验菌菌悬液0.5mL分别加入含有50mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角瓶中，其余操作同供试品试验组。

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