免疫胶体金实验

镍网薄片用1:100 的鼠抗GOD酶抗体孵育1h，后用1% BSA/PBS 液漂洗切片3 次共15 min 以除去未结合抗体
镍网薄片用1:10 稀释(用BSA/PBS) 羊抗鼠免疫胶体金（40 nm）室温孵育1 h
PBS 液漂洗切片3 次，1% 戊二醛固定切片5 min，双蒸水冲洗切片3 次
切片染色，室温干燥，电镜观察
备注： 鼠抗GOD抗体需要用GOD纯品注射小鼠收集血清 羊抗鼠免疫胶体金是直接购买的
镍网切片的制作时电镜的标准化制作过程，需要指导
染色液为4%醋酸铀与2%甲基纤维素1:9 混合(pH 4.0)
实验计划： ① 鼠抗GOD抗体的制备：目前已有GOD纯品，分子量在60 kDa 左右，需要小 鼠以及小鼠免疫，培养，血清的收集等实验操作，希望得到易小萍帮助 ② 镍网样品的制备与电镜观察：联系上师大的电镜室，先将所做的黑曲霉的 切片做出来，电镜观察菌体内部结构
实验原理
菌体 切片
结合 菌体
结合 菌体
GOD酶
鼠抗GOD 酶抗体
羊抗鼠 免疫胶 体金有菌球超薄切片的镍网制备
不同发酵期（生长期，稳定期，发酵后期）取样，过滤，洗涤
用固定液（2.5%戊二醛+4%多聚甲醛）室温固定1h
离心，洗涤（0.1M PBS pH 7.2），梯度脱水（各浓度乙醇）
⑥ 如果成功，还想再做一下CAT的免疫胶体金实验
环氧树脂浸透、包埋，超薄切片机切片，厚度70nm
切片捞在200 目的镍网上，37℃干燥备用
2. 免疫胶体金标记 镍网样品倒扣于5% H2O2 中浸泡10 min，除掉残留树脂 0.1% Gly孵育5 min封闭自由醛基，1%的牛血清白蛋白 PBS 缓冲液（BSA/PBS pH 7.2）孵育2 min 封闭非特异性结合位点
③ 购买与配置相关试剂
④ 免疫胶体金可行性实验：待样品准备完毕，需要做四组平行试验来确定实 验是否可行：A（无抗体孵育+无胶体金标记）；B（无抗体孵育+有胶体金 标记）；C（有抗体孵育+无胶体金标记）；D（有抗体孵育+有胶体金标 记）。 ⑤ 如果方案可行，取不同时期，不同条件下的菌体样品进行观察分析