抗体的提取与纯化
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(关键词:抗体;抗体的提取与纯化;盐析法;冷酒精沉淀法;DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白;SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG;离子交换层析)
精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术,避免蛋白变性。
如分离IgG时,多结合使
用盐析法与离子交换法,以求纯化。
提取IgM的方法也很多,如应用凝胶过滤与制备电泳法,或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法
取x ml血清加x ml生理盐水,于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵,硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃,3h以上,使其充分沉淀离心(3000rpm),20min,充上清,以xml生理盐水溶解沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上,[此时,(NH4)2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1~2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白,以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次,至萘氏试剂测透析外液无黄色,即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后,以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多,如蛋白质的浓度,盐的浓度,饱和度和pH,温度等都可影响盐析的结果,操作时要充分注意(参阅本章第二节)。
二、冷酒精沉淀法
分离过程如下。
血清加3倍体积的蒸馏水,调节pH至7.7(±)冷却到0℃。
在激烈搅拌的条件下,加预冷的酒精(-20℃)到最终浓度为20%,保持在-5℃。
产生的沉淀(A),含有大多数种类的免疫球蛋白。
沉淀A悬浮于25倍体积的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1,产生的沉淀(B),包括大部分的IgA 和IgM,IgG留在上清液内。
调节上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到最终浓度为25%,维持在-5℃。
所得到的沉淀(C)含有90%~98%IgG。
不同动物,IgG分离的条件和产量略有不同。
见表2-5。
从沉淀(B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物:将沉淀(B)悬浮在0℃水中,调节pH到5.1,离心去除不溶的蛋白。
调节上清液离子强度到0.01~0.0075,pH5.5。
然后加冷酒精到最终浓度为10%,保持在–2℃或-3℃低温,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。
表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件
物种 pH 沉淀条件 IgG产量
酒精浓度(%)离子强度
人 5.1 15. 0.01 65
山羊 5.2 0 0.01 65
家兔 5.2 10 0.01 70
大鼠 5.0 15 0.01 50
豚鼠 5.1 15 0.01 70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白
原理:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。
用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。
PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。
因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG.
(一)操作步骤
1.DEAE-Sephadex
A-50预处理称DEAE-SephadexA-50(下称A-50)5g,悬于500ml 蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。
按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml 的比例,将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性;再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理,最后以0.5mol/LNaOH 再处理一次。
处理完后,将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。
2.装柱
(1)将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
(2)将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。
等A-50。
等A-50凝胶沉降2~3cm高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1ml/min,同时连
续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
(3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口。
通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3.平衡
启开出水口螺旋夹,控制流速12~14滴/min。
使约2倍床体积的洗脱液流出。
并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。
4.加样及洗脱
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积2%,蛋白浓度以<100mg为宜)。
松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内,至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2~3次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。
并控制流速12~14滴/min。
5.收集
开始洗脱的同时就以试管进行收集。
每管收集3~5ml。
共收集10~15管。
6.测蛋白
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。
并以OD280nm为纵座标,以试管编号为横
座标,绘制洗脱曲线。
7.合并、浓缩
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以PEG (MW6000)浓缩至所需体积,加入0.02%NaN3防腐,于4℃保存备用。
长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8.A-50凝胶的再生
在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐。
然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。
近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时,以无水酒精洗2次,再置50℃温箱烘干,装瓶内保存。
(二)注意事项
(1)柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就能获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。
柱的直径增加,使流体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。
(2)纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。
样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析。
(3)所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。
(4)洗脱过程中应严格控制流速,切勿过快。
(5)上样的体积要小,浓度不宜过高。
(6)加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化
IgG及IgG亚类
(一)原理
葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力,并与不同IgG亚类的结合力有所差别。
改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亚类,可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
(二)操作步骤
用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶,15min。
按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶,(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。
↓
装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。
标本可用硫酸铵粗提物,先10000g离心除去杂质,必要时用0.22μm滤膜过滤,上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。
↓
加样,一般按25~30mg IgG/g湿胶比例加样,室温作用15min,用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗,到淋洗液OD值为<0.02。
↓
用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱,流速20ml/h。
如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0;纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。
↓
用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时,用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。
↓
收集洗脱液测OD值,根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。
(三)试剂器材
(1)SPA-Sepharose L-4B (pharmacia)
(2)磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3
(3)枸橼酸缓冲液0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0 +0.02% NaN30.1mol/LpH3.0
(4)1mol/L pH9.0 Tris溶液
(5)再生缓冲液:①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。
(四)注意事项
(1)SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵,可再生后反复使用10~20次左右。
方法:先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡,4℃贮存。
(2)SPA-Sepharose CL-4B亲合层析法还可用于:①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性;②除去木瓜蛋白酶或胃蛋
白酶水解IgG后的Fc段;③吸收或纯化免疫复合物。
(3)狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。
金黄色葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A,SPA)可与IC中IgG的Fc段结合。
将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上,再以酶标记的SPA与之反应,即可检测样本中有无IC。
1、试剂
(1)5%与2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制;
(2)牛血清白蛋白(BSA)缓冲液:用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。
含0.01mol/L EDT A、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA;
(3)HRP-SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶(HRP)制成结合物,最适工作浓度以方阵法滴定;
(4)热聚合人IgG:人IgG 10mg/ml,63℃加热20min制成。
2、操作步骤
(1)用PBS稀释SPA成5Ps/ml,包被聚苯乙烯反应板微孔,每孔0.1ml(对照孔不包被),置4℃过夜后洗涤3次备用;
(2)待测血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混匀,4℃过夜后1600r/min离心2 0min,弃上清,沉淀用2.5%PEG洗2次,加入PBS0.2ml和BSA缓冲液0.2ml,混匀,置37℃水浴30min,摇动,使完全溶解;
(3)将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中,置37℃60min,洗3次;各孔加底物溶液(OPD—H202)0.1ml,37℃20min使呈色。
每孔加2mol/LH2S041滴终止反应。
置酶标仪492nm测各孔吸光值;
(4)标准曲线制备:取正常人血清0.2ml,加热聚合人IsC(120ug/ml)0.2ml,再加PBS 0.4ml和5%PEG0.8ml,置4℃过夜。
同时做不加热聚合人耽的正常血清对照,以排除血清中干扰因素。
沉淀清洗同标本操作。
用稀释的BSA缓冲液(加等量0.01mol/LpH7.4PBS)1.6ml溶解并稀释成120、60、30、15、7.5ug/ml,与待测血清同法操作,制成工作标准曲线;
(5)结果判断:从待测血清吸光度值查标准曲线,即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC 含量(ug/ml)。
以高于正常对照X+2S,即大于28.4ug/ml为阳性。
3、注意事项
(1)热聚合人IgC应分装贮存于-20℃,不宜反复冻融,否则易解聚;
(2)PEG的浓度影响CIC沉淀量,须严格配制。
五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。
应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快,回收率和得率高,而且保持良好的生物学活性。
(一)原理
根据离子交换原理,将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上,通过增加洗
脱液中的离子强度,洗脱并收集蛋白峰。
(二)操作步骤
腹水离心10000 g,10min,除去细胞和杂质,在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液,使终浓度为40%饱和硫酸铵
↓搅拌20~30min
离心,沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS,对缓冲液A(pH8.5, 20mmol/L Tris缓冲液)透析除盐
↓4℃过夜
用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK
DEAE SPW离子交换层析柱
↓
洗脱流速1ml/min
0~1min :0→5%缓冲液B(20nmol/L
Tris, Ph 8.5,含2.0
mol/L醋酸钠)
1~2 min( 线性梯度洗脱):5→20%缓冲液B
20~22min:20→0%缓冲液B
↓
洗脱液用紫外280nm进行监测
↓
收集蛋白峰,进行含量、纯度和活性测定
(三)试剂和器材
(1)TSK
DEAE SPW离子交换层析柱(75mm×7.5mm,Bio
Rad)
(2)高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统)
(3)PBS,缓冲液A和B。
(四)注意事项
(1)所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。
(2)在本实验条件下,IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。
但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb
的存留时间(retention
time)有所差异。
【附录】
制备单克隆抗体常用的试剂
1.RPMT-1640培养液其中含2mmol/L 谷氨酰胺,25
mmol/L Hepes,5×10-5mol/L
2-巯基乙醇2.
RPMT-1640完全培养液上述溶液加10%~20%灭活小牛血清3.HT母液×100
次黄嘌呤(H)
1.0×10-2mol/L
136.1mg
胸腺嘧淀核苷(T) 1.6×10-3mol/L 38.8mg
蒸馏水100ml 4. A母液×100
氨基喋呤(A) 4×10-3mol/L
1.76mg
蒸馏水90.0ml 1mol/LNaOH 0.5ml
溶解后,加1mol/L
HCl 0.5ml,再补加蒸馏水至100ml 。
5.HAT选择培养液
RPMI-1640培养液
80ml
灭活小牛血清20ml
HT母液×100
1ml
A母液×100
1ml
用5%NaOH调节pH至7.4左右。
6.HT培养液
RPMI-1640培养液
80ml
灭活小牛血清
20ml
HT母×100
1ml
用5%NaOH调节pH至7.4左右。
Protein A Purification of Antibody
1. Reagents
(1) Affi-gel Protein-A Agarose (BioRad #153-6153)
(2) MAPS II Binding Buffer (BioRad # 153-6161)
(3) 0.314 g/ml diH2O
(4) MAPS II Elution Buffer (BioRad #153-6162)
(5) 0.023 g/ml diH2O
(6) MAPS II Regeneration Buffer (BioRad #153-6166
(7) 1M Tris, pH 9-11
(8) PBS
2. Procedure
(1) Dilute Ab 1:5 with Binding Buffer. Filter through a 0.22 m filter.
(2) Equilibrate column with at least 2 bed volumes of Binding Buffer
(3) Apply Sample.
Wash column with 5-6 bed volumes of Binding Buffer. Collect 1 ml fractions until b ase line is achieved.
Elute Ab with 5 bed volumes of Elution Buffer. Collect 1 ml fractions into 50 ml 1 M Tris, until base line is achieved.
Take 50 ml aliquots of each fraction for ELISA.
Pool fractions containing Ab. Dialyze against 2 x 4L PBS, overnight, 2-8℃.
Re-equilibrate column with Binding Buffer. Store column at 2-8℃.
Determine protein concentration of Ab, aliquot, and store at -20℃.
3. Note
Extinction Coefficient for IgG = 1.4 and for IgM = 1.2。