抗体的提取与纯化
抗体纯化方法
抗体纯化方法1. 引言抗体是一类免疫蛋白，具有识别和结合特定抗原的能力。
在生物医学研究和临床应用中，纯化高质量的抗体是非常重要的。
抗体纯化方法可以去除杂质，提高抗体的纯度和活性，从而提高其应用效果。
本文将介绍几种常见的抗体纯化方法。
2. 凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的纯化方法。
该方法利用不同孔径的凝胶过滤介质，将目标分子（如抗体）与较大分子（如蛋白质杂质）分离开来。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。
2.使用缓冲液进行洗脱，使较大分子无法通过凝胶柱而流出。
3.目标抗体由于分子大小适中，能够通过凝胶柱被保留下来。
4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
凝胶过滤层析法的优点是简单易行，不需要特殊设备，且适用于各种规模的实验室。
但其缺点是分离效率较低，只能实现较为粗略的纯化。
3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子之间特异性相互作用的纯化方法。
该方法利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体（如蛋白A、蛋白G等）的亲和层析柱中。
2.目标抗体与配体之间发生特异性结合。
3.使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。
4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
亲和层析法具有高选择性和高效率的优点，能够得到高纯度的抗体。
但其缺点是需要特定的亲和剂和配体，成本较高。
4. 离子交换层析法离子交换层析法是一种基于生物分子表面电荷的纯化方法。
该方法利用目标抗体与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的离子交换柱中。
2.使用缓冲液进行洗脱，使与固定离子相同电荷的分子无法通过离子交换柱而流出。
3.目标抗体由于表面电荷不同，能够通过离子交换柱被保留下来。
4.最后使用洗脱缓冲液改变pH或盐浓度等条件，将目标抗体从离子交换柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
抗体纯化的基本流程
抗体纯化的基本流程引言抗体纯化是生物技术领域中的重要工作之一，其目的是从复杂的混合物中分离和纯化抗体。
抗体纯化的基本流程涉及到多种技术和步骤，本文将全面、详细、完整地探讨这些内容。
什么是抗体在开始探讨抗体纯化的基本流程之前，我们先来了解一下什么是抗体。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质分子，可以识别并结合到体内外的抗原分子上，从而协助免疫系统抵御病原体侵袭。
抗体具有高度的特异性和亲和力，因此被广泛应用于医学诊断、药物研发和生物科学研究等领域。
抗体纯化的重要性抗体的纯化是从生物样品中分离和富集抗体的关键步骤，对于保证后续实验的可靠性和有效性至关重要。
纯化后的抗体可以用于分析抗原-抗体相互作用、制备单克隆抗体或用于治疗等多个方面。
抗体纯化的基本流程步骤一：产生抗体抗体在纯化之前需要首先通过免疫方法产生。
这通常包括以下步骤：1.抗原选择：选择与目标抗体结合的抗原，并合成或提取得到纯化的抗原。
2.免疫动物选择：选择合适的动物（如小鼠、兔子等）作为免疫动物。
3.免疫过程：将抗原注射到免疫动物体内，激发其产生特异性抗体。
4.收集免疫血清：从免疫动物的血液中收集含有抗体的免疫血清。
步骤二：预处理样品在开始抗体纯化之前，通常需要对样品进行一些预处理步骤，以去除杂质和提高纯化效果：1.样品收集：收集包含抗体的样品，如免疫动物的血清或细胞培养上清液。
2.去除大分子杂质：通过使用滤器或超速离心的方法，去除样品中的大分子杂质，如胶原蛋白、细胞碎片等。
步骤三：亲和层析亲和层析是抗体纯化中最常用的方法之一，它基于抗体与特定配体（如抗原或蛋白A/G）的高亲和性实现抗体的分离和富集。
1.根据抗体的特性选择合适的配体：根据抗体的免疫来源和特性，选择能够与之高亲和结合的配体。
2.固定配体：将配体固定在固相支持材料上，如琼脂糖、琼脂糖糖胶等。
3.样品加载：将预处理后的样品加入到亲和层析柱中。
4.洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如改变pH值、离子强度等，洗脱不结合的杂质。
4种常用抗体分离纯化工艺介绍
4种常用抗体分离纯化工艺介绍抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离，最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。
纯化过程中需要去除的工艺相关杂质包括细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分，需去除的产品相关杂质主要包括抗体片段和聚集体。
纯化过程还需具备足够的病毒灭活去除能力，以去除宿主细胞自身表达的内源病毒样颗粒和未及时发现的外源病毒。
大多数工艺利用ProteinA来捕获抗体，并利用了至少1个离子交换层析作为精纯步骤，仅少数工艺使用了疏水、羟基磷灰石和分子筛层析等步骤。
下图中显示了一个常见的抗体纯化工艺。
反应器收获液首先经过离心和过滤，去除细胞和细胞碎片，然后经过ProteinA层析捕获抗体,捕获后的抗体经低pH孵育后，通过两个离子交换层析进行精纯,然后进行病毒过滤，最后换液并调整抗体浓度，得到抗体原液。
工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。
这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。
工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。
这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。
抗体分离纯化工艺其中最常用的四种纯化方法，也就是今天的主角“四大名捕”。
我们接着往下看吧。
1、Protein A从原核金黄色葡萄球菌细胞壁分离的结合受体Protein A(~56kDa)与不同免疫球蛋白同型的Fc区以及人VH3家族的Fab区具有高度的亲缘关系。
进一步研究表明，Protein A仅限于与IgG亚类IgG1、IgG2和IgG4结合，与IgG3的反应性很低，约占总IgG的8%。
天然的Protein A有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域，结构示意图如下：Protein A的结构域示意图此结构的Protein A大量结合IgG的同时，其非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够，因此科学家利用基因工程的方法克隆Protein A 的基因并进行改造，得到重组型Protein A，其非特异性结合明显降低。
卵黄抗体的分离提取和纯化方法
卵黄抗体的分离提取和纯化方法
卵黄抗体的分离提取和纯化是一种重要的实验技术，用于从蛋黄中获取纯化的抗体。
以下是一种常见的卵黄抗体分离提取和纯化的方法。
首先，收集需要提取卵黄抗体的鸡蛋，并分离出蛋黄。
接下来，利用一种物理方法，如离心或冷冻解冻循环，将蛋黄细胞破裂开放，使得抗体被释放到溶液中。
然后，使用晶体胶过滤或离心的方法，去除残留的细胞碎片和大分子物质。
接下来，使用一种亲和层析技术，例如蛋白A/G层析，选择性地吸附卵黄抗体在固定相上，在此过程中可以选择不同的缓冲条件和负载材料，以便优化抗体与固定相之间的亲和性。
随后，通过洗脱步骤，用适当的洗脱缓冲溶解固定相上的抗体，使其从固定相上脱落，得到纯化的卵黄抗体。
最后，通过浓缩和纯化步骤，使得卵黄抗体的浓度得到提高，并去除可能的污染物。
综上所述，卵黄抗体的分离提取和纯化方法包括蛋黄细胞破裂、去除残留物、亲和层析、洗脱、浓缩和纯化等步骤。
这些方法可以有效地提取和纯化卵黄抗体，为后续的实验研究和应用提供优质的抗体材料。
抗体的提取与纯化
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
2置4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
3 置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。
4 末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02mol/L pH7.4 PBS溶解至xml装入透析袋。
对PBS 充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5 取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法分离过程如下。
血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。
在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。
产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。
沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。
调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。
所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。
不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。
见表2-5。
从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。
抗体的提纯实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握抗体提纯的基本原理和方法。
2. 学习并掌握利用亲和层析法、盐析法等方法对抗体进行提纯。
3. 评估提纯效果，确保抗体纯度。
二、实验原理抗体是一种具有特异性的蛋白质，主要存在于血清、组织液等体液中。
抗体提纯的目的是去除抗体中的杂质，提高其纯度和活性。
常用的抗体提纯方法有亲和层析法、盐析法、离子交换层析法等。
亲和层析法：利用抗体与抗原之间的高亲和力，将抗体吸附在特异性抗原上，通过洗脱剂洗脱抗原，实现抗体与抗原的分离。
盐析法：利用盐离子对蛋白质溶解度的影响，通过调节溶液中的盐浓度，使抗体沉淀出来。
三、实验材料1. 实验试剂：抗体溶液、抗原溶液、亲和层析柱、盐析剂、离子交换层析柱、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、分光光度计、移液器、培养箱、冰箱等。
四、实验步骤1. 亲和层析法（1）将抗体溶液过柱，用缓冲液平衡亲和层析柱。
（2）将抗原溶液加入亲和层析柱，使抗体与抗原结合。
（3）用洗脱剂洗脱未结合的抗原，收集抗体洗脱液。
（4）将抗体洗脱液离心，收集上清液。
2. 盐析法（1）将抗体溶液加入适量的盐析剂，调节盐浓度至抗体沉淀的适宜范围。
（2）静置一段时间，使抗体沉淀。
（3）离心收集抗体沉淀，用缓冲液溶解沉淀。
（4）检测抗体溶液的浓度和活性。
3. 离子交换层析法（1）将抗体溶液过柱，用缓冲液平衡离子交换层析柱。
（2）根据抗体带电荷性质，选择合适的离子交换层析柱。
（3）通过改变缓冲液的离子强度，使抗体吸附在层析柱上。
（4）用梯度洗脱剂洗脱抗体，收集抗体洗脱液。
（5）离心收集抗体洗脱液。
五、实验结果与分析1. 亲和层析法通过亲和层析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
通过SDS-PAGE电泳检测，抗体分子量与预期相符。
2. 盐析法通过盐析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
通过SDS-PAGE电泳检测，抗体分子量与预期相符。
3. 离子交换层析法通过离子交换层析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
抗体的检测和纯化(4)
• Protein A/G亲和层析 • 亲和层析是一种快速有效的生物活 性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对 目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得 较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应 用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂 贵,使用成本较高,限制了它的运用
• Protein A • A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
精度纯化
• 目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对 潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免 疫球蛋白、宿主DNA； • 对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、 其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析 出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能 有效的去除/灭活病毒。
建议的工艺
• 首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行 澄清 (Cell removal)； • 然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件 洗脱后直接pH 4.0病毒灭活； • 澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere； • 这一步离子交换之前或之后会有一步20nm 纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进 行缓冲液置换。 • 有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通 过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求
目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集 体和变体等。 常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、 疏水层析等。
抗体纯化应用的原理
抗体纯化应用的原理1. 引言在生物医学研究中，抗体纯化是一项非常重要的技术，它可以用来提取纯化抗体样品，以便用于研究和临床应用。
抗体纯化的原理通常涉及选择性地结合目标抗体并除去其他混杂物质，从而得到高纯度的抗体样品。
2. 抗体纯化的方法抗体纯化可以通过多种方法实现，以下是常用的几种方法：2.1. 蛋白A/G层析蛋白A/G是两种常用的蛋白质结合剂，它们能够选择性地结合免疫球蛋白IgG。
在蛋白A/G层析中，将抗体样品与蛋白A/G结合，然后经过洗脱，可以得到纯化的抗体。
2.2. 亲和层析亲和层析是一种基于抗原与抗体的专一亲和性结合原理的纯化方法。
在亲和层析中，将抗原结合在固定基质上，再将抗体样品加入，经过洗脱，可以得到纯化的抗体。
2.3. 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种高效、高分辨率的色谱技术，可以用于抗体的纯化。
在HPLC中，通过调节流动相和固定相的性质，可以实现对目标抗体的选择性保留和纯化。
2.4. 过滤纯化法过滤纯化法是一种简单而有效的抗体纯化方法。
通过选择性膜过滤技术，可以除去混杂物质，从而得到纯化的抗体样品。
3. 抗体纯化的原理抗体纯化的原理基于抗体与其他分子之间的特异性相互作用。
通过利用抗体与抗原结合的专一性，可以选择性地捕获目标抗体并除去其他成分。
抗体纯化的过程通常包括以下几个步骤：1.样品预处理：通常需要对样品进行预处理，去除干扰物质和杂质。
这可以通过离心、过滤、稀释等方法实现。
2.抗体捕获：根据纯化方法的选择，将样品与相应的固定基质或结合剂接触，以捕获目标抗体。
3.洗脱：通过适当的洗脱缓冲液，洗去非特异性结合的物质，从而除去杂质。
4.分离：将洗脱后的溶液进行分离，可以通过离心、过滤、纯化柱等方法分离目标抗体。
5.浓缩和纯化：最后，对目标抗体进行浓缩和纯化处理，以获得高纯度的抗体样品。
4. 抗体纯化的应用抗体纯化在生物医学研究和临床应用中有广泛的应用。
以下是一些常见的抗体纯化应用：•生物学研究：纯化的抗体用于生物学研究，如免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。
抗体的纯化与检测详细版
注意事项：选择 合适的荧光标记 抗体避免非特异 性结合
抗体纯化与检测的应 用
疾病诊断
抗体检测：通过检测抗体水平判断疾病状态 抗体纯化：提高抗体检测的准确性和灵敏度 抗体检测的应用：用于诊断多种疾病如传染病、肿瘤等 抗体纯化的应用：提高抗体检测的特异性和灵敏度降低假阳性和假阴性率
药物研发
抗体纯化与检测在药物研发中的作用：提高药物的疗效和安全性 抗体纯化与检测在药物研发中的具体应用：抗体筛选、抗体工程、抗体药物研发等 抗体纯化与检测在药物研发中的技术难点：抗体的纯化、抗体的检测、抗体的稳定性等 抗体纯化与检测在药物研发中的发展趋势：抗体药物的个性化治疗、抗体药物的靶向治疗等
步骤：样品制备、 电泳分离、转膜、 封闭、抗体孵育、 显色、结果分析
优点：灵敏度高、 特异性强、操作 简便、结果直观
应用：广泛应用 于蛋白质表达分 析、疾病诊断、 药物研发等领域
流式细胞术
原理：利用荧光 标记抗体通过流 式细胞仪检测细 胞表面抗原
优点：快速、灵 敏、准确
应用：免疫学、 肿瘤学、血液学 等领域
根据实验目的选 择检测方法：如 定量检测、定性 检测等
实验数据的分析和解读
数据的完整性：确保实验数 据的完整性避免遗漏和缺失
数据的时效性：确保实验数 据的时效性避免过时和失效
实验数据的准确性：确保实 验数据的准确性避免误差和 偏差
数据的解读：根据实验数据 进行合理的分析和解读得出
结论和结论
感谢您的耐心观看
生物科学研究
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 重要性
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 应用实例
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 发展趋势
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 挑战与机遇
抗体制备流程
抗体制备流程1. 引言抗体制备是生物医学研究领域中常用的实验技术之一。
通过制备特定的抗体，我们可以用于检测特定的蛋白质、细胞或其他分子，从而在研究中获得更加准确和可靠的结果。
本文将详细介绍抗体制备的流程，包括免疫原制备、动物免疫、抗体纯化等几个主要步骤。
2. 免疫原制备2.1 选择免疫原免疫原是指能够引起机体免疫系统产生抗体反应的物质。
在选择免疫原时，需要考虑以下几个因素：•目标蛋白质：免疫原应该是目标蛋白质或其片段，可以是纯化的蛋白质、合成的多肽或重组蛋白等。
•抗原性：免疫原应该具有足够的抗原性，能够激发免疫系统产生抗体反应。
•稳定性：免疫原应该具有足够的稳定性，可以在制备和储存过程中保持其完整性和活性。
2.2 免疫原制备制备免疫原的方法多种多样，常见的包括以下几种：1.纯化蛋白质：从细胞或组织中纯化目标蛋白质，获取单一纯度的免疫原。
2.合成多肽：根据目标蛋白质的氨基酸序列合成相应的多肽片段，作为免疫原使用。
3.重组蛋白：利用基因工程技术在表达系统中表达目标蛋白质的重组形式，作为免疫原。
3. 动物免疫3.1 动物选择选择合适的动物作为免疫宿主是成功制备抗体的重要因素。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子、鸡等。
选择免疫动物时需要考虑以下几点：•易于操作：动物应该易于操作和养护，能够适应实验室环境。
•免疫系统：动物的免疫系统应该对免疫原有良好的反应。
•抗原性：动物对免疫原应有较好的抗原性，能够产生高效的抗体反应。
3.2 免疫程序动物免疫的程序通常包括以下几个步骤：1.初次免疫：将制备好的免疫原与适当的佐剂混合，注射到动物体内。
注射的途径通常选择腹腔或皮下注射。
2.强化免疫：在初次免疫后，根据需要可以进行一定次数的强化免疫，以提高免疫效果。
3.血清采集：在免疫程度达到一定水平后，从动物体内采集血清，其中含有目标抗体。
4.抗体效价测定：通过合适的方法，测定血清中目标抗体的效价。
4. 抗体纯化4.1 抗体提取通过离心等方法，将血清中的抗体分离出来。
抗体纯化的原理和步骤
抗体纯化的原理和步骤抗体纯化，听起来是不是像一门高深的学问？其实，它就是把那些超级英雄般的抗体从一堆“杂质”中找出来的过程。
咱们的免疫系统就像一支警察队，抗体就是那些最勇敢、最聪明的警察，它们专门对付入侵的坏家伙——病毒、细菌等等。
不过，想把这些抗体从复杂的生物样品中提取出来，得有一套“秘籍”！今天，就来跟大家聊聊抗体纯化的原理和步骤，保证让你听得津津有味。
1. 抗体的基本知识1.1 抗体是什么首先，咱们得知道抗体是什么。
这玩意儿其实是由B细胞生产的蛋白质，负责识别和中和外来的侵略者。
可以想象成是专门为打击“罪犯”而生的特工，它们不仅能认得出坏家伙，还能给它们上“刑”。
每种抗体对特定的“罪犯”都有极强的专一性，这让它们在免疫反应中发挥着至关重要的作用。
1.2 抗体的种类抗体可分为多种类型，比如IgG、IgA、IgM等等。
每种都有它独特的功能，就像每位英雄都有自己的超能力。
IgG是最常见的，负责大多数的免疫防御，IgA则主要在黏膜表面发挥作用，像是个“门卫”。
要纯化抗体，了解这些小伙伴的特性可真是必不可少。
2. 抗体纯化的原理2.1 为什么需要纯化好吧，明白抗体是什么后，咱们接下来得搞清楚，为什么要纯化抗体。
想象一下，假如你去参加聚会，周围全是陌生人，你得找到自己的朋友才能安心聊天。
抗体纯化就是这样的过程——把那些“杂质”都清理掉，只留下那些“志同道合”的抗体。
纯化后的抗体才能够更有效地用于科研、治疗等各种用途。
2.2 纯化的方法抗体纯化的方法有不少，比如亲和层析、盐析、透析等等。
亲和层析可以说是个“万里挑一”的高手，它利用抗体和抗原之间的特异性结合，像钓鱼一样，把目标抗体捞出来。
盐析则是利用盐的溶解度差异，让抗体聚集在一起，轻松搞定一部分杂质。
而透析就像是洗衣机，把不需要的“小毛病”洗掉，留下干净的抗体。
3. 抗体纯化的步骤3.1 实验步骤详解接下来，咱们就聊聊具体的步骤吧。
首先，得准备好样品，通常是血清或细胞培养液。
抗体的纯化原理
抗体的纯化原理抗体的纯化是指从混合溶液中将目标抗体分离出来，并获得高纯度和高活性的过程。
纯化抗体的目的是为了获得足够纯度的抗体以进行进一步的研究和应用。
抗体的纯化过程通常包括以下几个步骤：1. 前处理：在样品中去除杂质物质，例如细胞碎片、核酸、亲和素等。
常用的方法包括离心、过滤和沉淀等。
2. 离子交换层析：采用离子交换树脂分离抗体。
离子交换树脂上带有正电荷或负电荷，可以与抗体的电荷相互作用，使抗体与其他组分分离。
常见的离子交换树脂有DEAE（二乙氨基乙基）和CM（羧甲基）等。
3. 亲和层析：利用特定配体与抗体之间的高亲和力进行分离。
常见的亲和层析方法包括免疫亲和层析和亲和素层析。
免疫亲和层析是将抗体与特定配对抗原或抗原类似物结合，再通过洗脱实现抗体的分离纯化。
亲和素层析则是通过特异性结合分离靶抗体，例如蛋白A层析可以专一地结合某些抗体的Fc区。
4. 凝胶层析：根据抗体的分子量和电荷进行分离。
常用的凝胶层析方法包括凝胶过滤层析、凝胶电泳等。
凝胶层析可通过分子筛效应实现抗体的分离纯化。
5. 毒物素标记抗体净化：通过毒物素结合蛋白（例如A链）与抗体上Fc区的亲和作用，实现抗体的纯化。
6. 逆流层析：通过逆向液流使混合物在固相材料中逆流，根据成分的亲和力进行分离。
逆流层析可与其他纯化方法结合使用，提高纯化效果。
7. 高效液相色谱（HPLC）：利用高速流动液相通过固定相分离抗体。
常见的HPLC 方法包括离子交换HPLC、亲和HPLC、尺寸排除（分子筛）HPLC和亲和逆相（含酸）HPLC等。
8. 超滤和浓缩：通过膜过滤器来去除小分子物质，实现抗体的纯化。
在进行抗体纯化过程中，可以根据特定的抗体特性和目标纯化效果的要求选择合适的方法，也可以结合多种方法进行联合纯化，提高纯化效果和纯化收率。
总而言之，抗体的纯化过程是通过利用抗体与其他成分之间的相互作用进行分离，包括物理性质（如电荷、分子量）、结构特异性（如亲和力）和化学亲和力（如特定配体结合）等。
抗体纯化方式
抗体纯化方式抗体纯化是从混合物中分离出单一抗体的过程。
该过程包括多个步骤，其中一些步骤是特定于某种抗体的，而其他步骤是适用于各种不同的抗体。
下面将介绍几种常用的抗体纯化方式。
1.亲和层析：亲和层析是最常用的抗体纯化技术之一。
该技术涉及使用特定的亲和剂来吸附目标抗体。
通常使用亲和剂与目标抗体分子之间的相互作用来实现吸附。
最常用的亲和剂是具有与抗体结合特异性的抗原。
在亲和层析中，杂质成分会快速流过树脂，而目标抗体会与聚合物中的相应亲和剂结合并保留在材料中。
接下来，可以使用洗脱剂从树脂上洗出目标抗体。
2.离子交换层析：离子交换层析可用于强制目标抗体通过含有逆离子的树脂以进行附着。
该技术将目标抗体与树脂上的离子交换树脂相互作用，从而实现抗体的分离和纯化。
离子交换层析可分为阳离子交换和阴离子交换两种类型。
在该过程中，目标抗体在树脂上强附着，而非目标抗体则流经树脂，因为它们与树脂的亲和力较低。
3.凝胶过滤：凝胶过滤是一种基于分子量的方法，可用于将目标抗体与其他高分子化合物分离。
在这种方法中，最初的混合物通过一种聚合物凝胶柱，分子量较大的组分无法通过凝胶，因此被分离并保留在柱中。
目标抗体分子量较小，因此可以通过凝胶流出。
4.透析：透析是一种渐进性的纯化技术，可以用于除去小分子化合物和无用的杂质，包括离子、杂质蛋白质和难溶杂质。
该过程包括使用透析袋和具有特定分子截止率的孔径尺寸的膜，并将混合物与缓冲溶液混合。
由于混合物中小分子量的组分比大分子量分子经透析膜逃逸的速度快，因此它们会在膜表面生成梯度，并被移除。
目标抗体粘附在透析袋内仍然存在。
总之，每个纯化步骤都有其优缺点，在选择纯化过程时，必须考虑到抗体的理化性质以及最终的应用目的。
一个成功的抗体纯化过程需要高纯度、高产量和快速操作的平衡。
抗体的制备与纯化技术
2）克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。 克隆化的方法主要有：有限稀释法、单个细胞显微操作法、软琼脂培养法
融合后细胞在HAT培养基[次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨甲蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（thymidine），故名HAT培养基]中存活情况（脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。） 脾细胞（ HGPRT+, TK+, 不能长期生长） 骨髓瘤细胞（ HGPRT-, TK-，不能生长 ） 杂交瘤细胞（ HGPRT+, TK+ ，能够生长）
一、抗原制备
可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴定后才能用做免疫原。 （1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在4 ℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。 （2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。 超声破碎：一次超声1～2min，总时间为10～15min。
抗体纯化的步骤
抗体纯化的步骤
抗体纯化的步骤通常包括以下几个主要步骤：
1. 细胞培养和抗体收集：首先，在体外培养细胞系，产生含有目标抗体的培养上清液。
在细胞培养周期结束后，通过离心等方式收集上清液。
2. 预处理和去除杂质：上清液中可能存在各种杂质，如细胞碎片、核酸、蛋白质杂质等。
这些杂质可能影响纯化后的抗体的纯度和活性。
因此，通常需要进行预处理步骤，如酸性沉淀、超滤或胶体沉淀等，以去除这些杂质。
3. 亲和层析或离子交换层析：亲和层析是一种通过抗体与特定亲和基质之间的非共价相互作用来分离目标抗体的方法。
通常，可以使用具有特定亲和性的树脂或基质，如蛋白A、蛋白G
或蛋白L等，来捕获目标抗体。
离子交换层析则是利用目标
抗体与固定在离子交换树脂上的离子进行交换，以实现分离纯化目的。
4. 尺寸排阻层析：尺寸排阻层析是一种根据分子大小进行分离的方法。
在这一步骤中，将目标抗体溶液通过精细孔径的树脂或基质，大分子如聚合物或蛋白质会被孔径所限，而小分子如抗体则能够通过孔径并被收集。
5. 进一步纯化和浓缩：经过尺寸排阻层析之后，抗体溶液可能还有一些未纯化的杂质存在。
为了进一步提高纯度，可以使用离子交换、亲和性或亲水性树脂、凝胶过滤、逆流层析等技术
来进行后续的纯化和浓缩。
6. 再溶和储存：最后，将纯化的抗体溶液进行最终的调整、再溶和储存，使其达到理想的浓度和稳定性，以备后续实验或应用使用。
需要注意的是，实际的抗体纯化步骤可能因为目标抗体的性质、所用的纯化技术的选择和实验室的具体流程而有所不同。
上述步骤只是一般的抗体纯化常见方法的大致流程。
单克隆抗体纯化过程
单克隆抗体纯化过程引言单克隆抗体是一种高度特异性的蛋白质，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。
单克隆抗体的纯化是制备高纯度、高活性的单克隆抗体的关键步骤之一。
本文将详细介绍单克隆抗体纯化过程及其相关技术。
单克隆抗体纯化过程1. 细胞培养与收获单克隆抗体的制备首先需要进行细胞培养。
通常使用哺乳动物细胞（如CHO细胞）作为表达宿主，将表达目标单克隆抗体的重链和轻链基因转染到CHO细胞中。
经过适当的培养条件，使得CHO细胞表达目标单克隆抗体。
当细胞达到一定密度后，可以进行收获。
收获过程中，需要将培养基与细胞分离，并将细胞沉淀下来。
常用的方法有离心和滤液等。
2. 细胞破碎与抗体提取收获的细胞需要进行破碎，以释放细胞内的抗体。
细胞破碎可以通过超声波、高压均质器、刀式破碎机等方法实现。
破碎后的细胞溶液中含有目标单克隆抗体、细胞碎片和其他杂质。
为了提取目标单克隆抗体，需要进行固液分离。
常用的方法有离心和滤液等。
离心可以将细胞碎片和大颗粒杂质沉淀下来，而滤液可以去除较小颗粒的杂质。
3. 亲和层析亲和层析是单克隆抗体纯化过程中最常用的方法之一。
通过利用抗体与特定配体（如蛋白A或蛋白G）之间的特异性结合，将目标单克隆抗体选择性地吸附到固定在亲和树脂上的配体上。
亲和层析通常包括以下步骤： - 树脂平衡：将亲和树脂与缓冲液进行平衡，以确保树脂处于最佳状态。
- 样品加载：将含有目标单克隆抗体的样品加入亲和树脂中，使得抗体与配体结合。
- 洗脱：使用特定的洗脱缓冲液，将非特异性结合的杂质洗脱，保留目标单克隆抗体。
- 再生：通过使用再生缓冲液，将目标单克隆抗体从亲和树脂上解离下来，以便进行下一轮层析。
4. 尺寸排阻层析尺寸排阻层析是一种基于分子大小差异的纯化方法。
通过利用填充在柱子中的尺寸排阻树脂，较大分子（如聚合物）被排除在外，而较小分子（如单克隆抗体）则可以通过树脂。
这样可以有效去除聚合物等大分子杂质。
尺寸排阻层析通常包括以下步骤： - 树脂平衡：将尺寸排阻树脂与缓冲液进行平衡。
常用抗体纯化方法
常用抗体纯化方法抗体纯化是分离和纯化单克隆或多克隆抗体的方法，以获得高纯度和高活性的抗体样品。
常用的抗体纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和电泳法、硫酸铵沉淀法等等。
下面将对常用的抗体纯化方法进行详细介绍。
1.亲和层析法：亲和层析法是一种基于抗原-抗体互作原理的分离纯化方法。
先制备含有抗原的固相材料，如亲和树脂或亲和膜，然后将抗体样品与这些固相材料接触，使抗体与抗原结合，其他非特异性蛋白质被洗脱，最后用适当的溶液洗脱目标抗体。
这种方法可以用于多克隆或单克隆抗体的纯化。
2.离子交换层析法：离子交换层析法是利用样品中的离子性蛋白质与离子交换树脂（正离子交换或负离子交换）之间的相互作用进行分离的方法。
通过改变洗脱缓冲液的离子强度和pH值，可以将目标抗体从离子交换树脂上洗脱下来。
这种方法适用于广泛的抗体样品，可以快速纯化大量的抗体。
3.凝胶过滤法：凝胶过滤法是一种分子大小分离纯化方法，适用于分离分子量较大的抗体。
基本原理是通过调节凝胶孔隙大小，使大分子如抗体可以滞留在凝胶中，而小分子如低分子量杂质则可以通过凝胶孔隙逸出。
这种方法操作简单，纯化速度快，适合于大量抗体的纯化。
4.亲和电泳法：亲和电泳法是利用抗体在电场中迁移速度与分子特性有关的原理进行纯化的方法。
可以通过改变电场强度、溶液pH值和溶液离子浓度等参数来调节抗体的迁移速度，从而实现抗体的纯化。
亲和电泳法适用于纯化低丰度目标抗体和快速分离纯化。
5.硫酸铵沉淀法：硫酸铵沉淀法是利用硫酸铵的沉淀作用将目标抗体从混合物中分离出来的方法。
通过调节溶液的硫酸铵饱和度和沉淀时间，可以得到纯度较高的抗体样品。
该方法简单、快速，适用于大量抗体的纯化。
总的来说，抗体纯化方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据具体的实验要求和抗体性质选择最适合的纯化方法。
同时，也可以结合两种或多种方法进行联合纯化，以获得更高纯度和活性的抗体。
详细介绍抗体的分离纯化
步骤如下: 1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v); 2.在4度搅拌4小时; 3.17,000g离心; 4.丢弃沉淀; 5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中;
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7
苯酚红
苯酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然并不直接的影响纯化,但是苯酚红可能结合 到某些纯化介质上,应该尽可能早的被除去。苯酚红能够在pH>7时结合在阳离子柱上。
任何离子通过柱时的
移动速率取决于与离 子交换剂的亲和力、 电离程度和溶液中各 种竞争性离子的性质 和浓度。
离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂 的玻璃管（1.5 cm×15 cm）中进行的。 24
透析法 超滤法 葡聚糖凝胶G50层析法。
20
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第三节 离子交换层析法
离子交换层析法（ion exchange chromatography， IEC） 是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结
合力的差别，而进行分离的一种技术。
广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。
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沉淀剂
可用于高脂蛋白的样品,例如腹水
沉淀脂蛋白
可能会不可逆的使蛋白变 性,适合于小肽 的制备或 者制备电泳样品 沉淀聚集的核酸蛋白 沉淀聚集的核酸蛋白 沉淀核酸 沉淀血清或者腹水中的大 量蛋白,仅把免
15
0.1% (w/v) 1% (w/v) 1% (w/v) 1:15 (w/w) 抗体含量应该大于 1mg/ml
注意： • 对于少量的样品或者蛋白能吸附在滤膜上，可以用10000×g离心15分钟。 • 对于细胞样品，可以在40000到50000×g离心15分钟，若样品需要短处理时间，可以减少到10到 15分钟。 • 离心时使用冷冻功能，并且在冷室或者离心机中提前预冷转子。 • 血清样品可以在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩余的酯类。
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(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG；离子交换层析)精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法分离过程如下。
血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。
在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。
产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。
沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA 和IgM，IgG留在上清液内。
调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。
所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。
不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。
见表2-5。
从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。
调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。
然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。
表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件物种 pH 沉淀条件 IgG产量酒精浓度（%）离子强度人 5.1 15. 0.01 65山羊 5.2 0 0.01 65家兔 5.2 10 0.01 70大鼠 5.0 15 0.01 50豚鼠 5.1 15 0.01 70三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。
用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。
PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。
因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.（一）操作步骤1．DEAE-SephadexA-50预处理称DEAE-SephadexA-50（下称A-50）5g，悬于500ml 蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。
按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml 的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/LNaOH 再处理一次。
处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。
2．装柱（1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（2）将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。
等A-50。
等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
（3）关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。
通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。
使约2倍床体积的洗脱液流出。
并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4．加样及洗脱启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜）。
松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。
并控制流速12～14滴/min。
5．收集开始洗脱的同时就以试管进行收集。
每管收集3～5ml。
共收集10～15管。
6．测蛋白以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。
并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。
7．合并、浓缩将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG （MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存备用。
长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8．A-50凝胶的再生在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。
然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。
近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
（二）注意事项（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。
柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。
样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。
（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。
（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。
（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化IgG及IgG亚类（一）原理葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。
改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
（二）操作步骤用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。
按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）。
↓装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。
标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。
↓加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。
↓用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。
如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。
↓用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。
↓收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。
（三）试剂器材（1）SPA-Sepharose L-4B （pharmacia）（2）磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3（3）枸橼酸缓冲液0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0 +0.02% NaN30.1mol/LpH3.0（4）1mol/L pH9.0 Tris溶液（5）再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。
（四）注意事项（1）SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。
方法：先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。
(2)SPA-Sepharose CL-4B亲合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。
（3）狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。
金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可与IC中IgG的Fc段结合。
将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上，再以酶标记的SPA与之反应，即可检测样本中有无IC。
1、试剂（1）5%与2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制；（2）牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。
含0.01mol/L EDT A、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA；（3）HRP-SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶（HRP）制成结合物，最适工作浓度以方阵法滴定；（4）热聚合人IgG：人IgG 10mg/ml，63℃加热20min制成。
2、操作步骤（1）用PBS稀释SPA成5Ps/ml，包被聚苯乙烯反应板微孔，每孔0.1ml（对照孔不包被），置4℃过夜后洗涤3次备用；（2）待测血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混匀，4℃过夜后1600r/min离心2 0min，弃上清，沉淀用2.5%PEG洗2次，加入PBS0.2ml和BSA缓冲液0.2ml，混匀，置37℃水浴30min，摇动，使完全溶解；（3）将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置37℃60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H202）0.1ml，37℃20min使呈色。