抗体的提取与纯化
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(关键词:抗体;抗体的提取与纯化;盐析法;冷酒精沉淀法;DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白;SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG;离子交换层析)
精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术,避免蛋白变性。如分离IgG时,多结合使
用盐析法与离子交换法,以求纯化。提取IgM的方法也很多,如应用凝胶过滤与制备电泳法,或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法
取x ml血清加x ml生理盐水,于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵,硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃,3h以上,使其充分沉淀离心(3000rpm),20min,充上清,以xml生理盐水溶解沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上,[此时,(NH4)2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1~2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白,以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次,至萘氏试剂测透析外液无黄色,即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后,以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多,如蛋白质的浓度,盐的浓度,饱和度和pH,温度等都可影响盐析的结果,操作时要充分注意(参阅本章第二节)。
二、冷酒精沉淀法
分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水,调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下,加预冷的酒精(-20℃)到最终浓度为20%,保持在-5℃。产生的沉淀(A),含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1,产生的沉淀(B),包括大部分的IgA 和IgM,IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到最终浓度为25%,维持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98%IgG。不同动物,IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀(B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物:将沉淀(B)悬浮在0℃水中,调节pH到5.1,离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%,保持在–2℃或-3℃低温,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。
表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件
物种 pH 沉淀条件 IgG产量
酒精浓度(%)离子强度
人 5.1 15. 0.01 65
山羊 5.2 0 0.01 65
家兔 5.2 10 0.01 70
大鼠 5.0 15 0.01 50
豚鼠 5.1 15 0.01 70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白
原理:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG.
(一)操作步骤
1.DEAE-Sephadex
A-50预处理称DEAE-SephadexA-50(下称A-50)5g,悬于500ml 蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml 的比例,将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性;再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理,最后以0.5mol/LNaOH 再处理一次。处理完后,将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。2.装柱
(1)将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
(2)将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2~3cm高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1ml/min,同时连
续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
(3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3.平衡
启开出水口螺旋夹,控制流速12~14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。
4.加样及洗脱
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积2%,蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内,至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2~3次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12~14滴/min。
5.收集
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。
6.测蛋白
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标,以试管编号为横
座标,绘制洗脱曲线。
7.合并、浓缩
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以PEG (MW6000)浓缩至所需体积,加入0.02%NaN3防腐,于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8.A-50凝胶的再生
在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时,以无水酒精洗2次,再置50℃温箱烘干,装瓶内保存。
(二)注意事项
(1)柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就能获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱的直径增加,使流体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。
(2)纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析。
(3)所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。(4)洗脱过程中应严格控制流速,切勿过快。
(5)上样的体积要小,浓度不宜过高。
(6)加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化