琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤DNA的琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA 的大小和纯度，以及进行DNA分子的分离和纯化。
凝胶电泳实验可以帮助我们确定DNA样本的大小和获得纯化的DNA片段供进一步研究使用。
下面是DNA琼脂糖凝胶电泳实验的原理和操作步骤。
【原理】DNA琼脂糖凝胶电泳是根据DNA分子在电场中的不同迁移速率来分离大小不同的DNA片段。
琼脂糖凝胶是一种凝胶状物质，其孔隙大小能够将DNA分子限制在一定范围内，较大的DNA分子迁移速率较慢，而较小的DNA分子迁移速率较快。
琼脂糖凝胶通常是在平均浓度为1%至2%之间的范围内制备，以便在不同大小的DNA分子之间提供适当的分辨率。
实验中，DNA样品通过切割酶或PCR等方法获得，样品经过核酸电泳缓冲液稀释，并在琼脂糖凝胶板上进行电泳。
凝胶板两侧连接电源，DNA 的带电粒子将在电场的作用下从负极迁移到正极，迁移过程中形成DNA的“条带”，条带的位置和长度反映了DNA的大小。
通常，DNA条带由荧光染料或核酸染料标记，以便在电泳结束后进行可视化。
【操作步骤】以下是DNA琼脂糖凝胶电泳实验的一般操作步骤：1.制备琼脂糖凝胶板：a.准备琼脂糖粉末和核酸电泳缓冲液（通常为TAE或TBE缓冲液）。
b.按照说明书将琼脂糖粉末溶解于核酸电泳缓冲液中。
c.将溶液加热至沸腾并搅拌，使琼脂糖完全溶解。
d.将溶液倒入预先准备好的电泳仓中，插入梳子或制备好的孔板，使其凝固。
2.样品制备：a.提取DNA样品并测定其浓度。
b. 将DNA样品稀释到适当浓度，通常为10-50 ng/μL。
c. 添加适当的加载缓冲液，通常是一些染料和甘胺酸（glycine）或其他添加剂。
3.DNA加载和电泳：a.打开琼脂糖凝胶仓盖，将DNA样品负载于凝胶孔内。
b.将DNA负载区域和样品标注在电泳仓中，以便在电泳结束后可以准确识别DNA带。
c.关闭盖子，将电泳仓放入电泳设备中。
dna琼脂糖凝胶电泳条件
dna琼脂糖凝胶电泳条件DNA琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分析技术，广泛应用于分子生物学和遗传学研究中。
凝胶电泳通过将DNA片段在电场作用下沿凝胶运动，根据片段大小的不同被分离出来，从而实现对DNA样品的检测和分析。
本文将详细介绍DNA琼脂糖凝胶电泳的条件和步骤，并解释其原理和应用。
DNA琼脂糖凝胶电泳条件的设定是成功进行分析的关键。
下面将一步一步回答关于电泳条件的问题。
1. 凝胶选择：DNA琼脂糖凝胶电泳通常使用琼脂糖（agarose）凝胶，因其透明度高、质地均匀且易于制备和使用。
琼脂糖的浓度通常在0.5%至2%之间，视待测DNA片段的大小而定。
较长的DNA片段，一般需要较低浓度的琼脂糖。
2. 缓冲液选择：DNA琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液是TAE（三乙酸铝溶液）或TBE（三硼酸盐溶液）。
这两种缓冲液都能提供适当的离子强度和pH值，维持DNA 片段的稳定移动。
常见的TAE缓冲液配方是：40 mM三乙酸（Tris-Acetate）、1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）。
TBE缓冲液配方为：90 mM三硼酸（Tris-Borate）、1 mM EDTA。
在使用缓冲液前，必须经过滤以去除杂质。
3. 电场强度设定：电泳过程中的电场强度直接影响DNA片段的迁移速度，因此需要根据待测DNA片段的大小和琼脂糖浓度来设定适当的电压。
通常，电场强度设置在5至10 V/cm之间，以避免DNA的热失活和琼脂糖的熔化。
4. 标准品选择：为了对待测DNA片段的大小进行估测，我们需要在电泳实验中加入标准品。
标准品是一系列已知大小的DNA片段，通常以Kb（千碱基对）为单位。
标准品可以购买或通过PCR扩增获得。
根据标准品的迁移位置和待测样品的迁移位置，可以估测待测DNA片段的大小。
5. 采样和加载样品：将待测DNA样品与DNA标记染料混合（如溴化乙锭）后，小心加载到琼脂糖凝胶的预制孔中。
为了减少加载误差，可以在样品中加入DNA大小标记品和负载控制品（如碱基作为分子量标准品）。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
3. 加样
• 将DNA样品（5ul）与6 × 上样缓冲液（1ul） 混匀后， 用微量加样枪小心加入样 品孔内。
– 注意加样枪的枪头不可插入 过深，以免刺穿凝胶，导致 样品外溢。
• 每加完一个样品要更换枪 头，以防止EB污染。电泳
• 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的 一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极 之间的距离计算）
• 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆操作。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
电泳指示剂：
• 核酸电泳常用的指示剂有两种 – 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）； – 二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ）， 它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝 胶中的迁移率比溴酚蓝慢
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
• 银染色
– 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形 成稳定的复合物，然后用还原剂如甲 醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳 带染成黑褐色。
– 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色， 也用于琼脂糖凝胶染色。
– 灵敏度比EB高200倍，但银染色后， DNA不宜回收
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
• 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，
停止电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
5. 结果观察
• 电泳结束后，将凝胶板取出。 在紫外仪上观察电泳带及其位 置，记录实验结果。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
注意事项
1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否 则温度太高会使制板变形；
• 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下， 使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而 达到分离核酸片段检测其大小的目的。
DNA质量与浓度的琼脂糖凝胶电泳法测定试验原理
在进行琼脂糖凝胶电泳时，应保证样品中DNA的质量浓度在一定范围内，以确保实验结果 的准确性和可靠性。
04 琼脂糖凝胶电泳法的操作 步骤
琼脂糖凝胶的制备
遗传病筛查
通过分析患者的基因组DNA，可 以诊断遗传性疾病，预测遗传风险。
个体化医疗
随着基因组学和分子生物学的发展， 琼脂糖凝胶电泳在个体化医疗领域 的应用前景广阔，如肿瘤诊断和治 疗、药物反应预测等。
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操作简便
该方法操作简单，易于掌握，适合于实验室常规应用。
适用范围广
琼脂糖凝胶电泳法可用于各种DNA样品的检测，如PCR 产物、基因组DNA等。
直观性
通过染色或荧光染料染色，可以直接观察DNA条带的位 置和大小，方便对结果进行判断。
缺点
易受DNA样品纯度的影响
检测灵敏度较低
琼脂糖凝胶电泳法对于DNA样品的纯度要 求较高，如果样品中含有蛋白质、RNA等 杂质，会影响电泳结果。
01
DNA分子在琼脂糖凝胶中迁移时 受到电场的作用，由于DNA分子 具有负电荷，因此会向正极方向 迁移。
02
DNA分子的迁移速率与DNA的大 小、构象和浓度等因素有关。较 小的DNA片段在凝胶中迁移较快 ，而较大的DNA片段则迁移较慢 。
DNA质量与浓度的关系
DNA的质量浓度是指单位体积中DNA分子的数量，通常以ng/μL或pg/μL表示。
分光光度法
总结词
利用DNA在280nm处的紫外吸收峰， 可以测定DNA的浓度。
琼脂糖凝胶电泳浓度选择
选择合适的琼脂糖凝胶浓度是进行电泳的关键步骤，因为它直接影响到电泳的效果和分离分辨率。
选择凝胶浓度的原则主要基于要分离的DNA片段的大小。
一般而言，对于较大的DNA片段，需要选择较低浓度的凝胶，而对于较小的DNA 片段，则应选择较高浓度的凝胶。
在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段在电场的作用下移动的速度取决于其大小、形状和所带电荷。
高浓度的凝胶意味着更强的阻力，导致大片段的DNA移动得更慢。
因此，为了更好地分离大片段的DNA，需要降低凝胶的浓度。
相反，小片段的DNA在低浓度的凝胶中会遇到较小的阻力，因此移动得更快，有利于分离。
此外，电泳的温度也是一个考虑因素。
在高温下，DNA的迁移率会增加，因此，如果电泳过程中温度升高，应选择较低的凝胶浓度，以减少影响。
对于特定的DNA片段大小范围，有一个推荐的琼脂糖凝胶浓度范围。
例如，对于200-500bp的DNA片段，推荐使用1.5%的凝胶浓度；对于500-1000bp的片段，使用1.0%的浓度；对于1000-2000bp的片段，使用0.8%的浓度；而大于2000bp 的片段，应使用0.5%的凝胶浓度。
不过，最佳的凝胶浓度还应通过实验来确定。
在实际操作中，可以尝试几个不同的浓度，然后根据结果选择最适合的浓度。
总的来说，选择合适的琼脂糖凝胶浓度是电泳成功的关键因素之一。
通过仔细考虑并实验确定最佳浓度，可以得到清晰、准确的电泳结果。
DNA琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳进行DNA/RNA定量原理DNA（RNA）定量分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。
此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。
在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNA （RNA）量的多少。
这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准。
琼脂糖凝胶的配制根据所需凝胶的浓度秤取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量 EB 混匀，适当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔，如有气泡产生则用玻璃棒驱除，不能过早拔除梳子，应待凝胶完全凝结后才能拔除梳子。
3．P1、P2、P3的配制P1 的配制：在 800ml 去离子水中溶入 Tris 碱 6.06g，Na2EDTA?2H2O 3.72g，用 HCl 调整 pH 至 8.0，用去离子水调整容积至1升，每升P1内加入RNaseA100mg。
P2 的配制：在 950ml 去离子水中溶入 NaOH 8.0g，20％SDS 50ml，调整容积至 1 升。
P3 的配制：在 500ml 去离子水中溶入醋酸钾 294.5g，用冰醋酸调整 pH 值至 5.5，用去离子水调整容积至1升。
4．常用缓冲液：TEpH 7.410mmol/LTris?Cl （pH7.4）1mmol/L EDTA（pH8.0）pH 7.610mmol/LTris?Cl （pH7.6）1mmol/L EDTA（pH8.0）pH 8.010mmol/LTris?Cl （pH8.0）1mmol/L EDTA（pH8.0）STE（亦称 TEN）0.1mmol/L NaCl10mmol/LTris?Cl （pH8.0）1mmol/L EDTA（pH8.0）STET0.1mmol/L NaCl10mmol/LTris?Cl （pH8.0）1mmol/L EDTA（pH8.0）5%Triton X-100TNT10mmol/LTris?Cl （pH8.0）150mmol/L NaCl0.05% Tween 20电泳缓冲液Tris-乙酸（TAE）：50×浓贮存液（每升）：242g Tris 碱5 7.1ml 冰乙酸100ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0）使用时再稀释50倍。
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。
注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验⼀、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA ⽚段的常⽤技术。
把DNA样品加⼊到⼀块包含电解质的多孔⽀持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分⼦的双螺旋⾻架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应。
具有不同的相对分⼦质量的DNA⽚段泳动速度不⼀样，因⽽可依据DNA分⼦的⼤⼩来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分⼦质量的DNA，也可以分离相对分⼦质量相同，⽽构型不同的DNA分⼦。
在电泳过程中可以通过⽰踪染料或相对分⼦质量标准参照物和样品⼀起进⾏电泳⽽得到检测。
相对分⼦质量标准参照物相对可以提供⼀个⽤于确定DNA⽚段⼤⼩的标准。
在凝胶中加⼊少量溴化⼄锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分⼦可插⼊DNA的碱基之间，形成⼀种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红⾊荧光，因此也可对分离的DNA进⾏检测。
⼀般琼脂糖凝胶电泳适⽤于⼤⼩在0.2kb～50kb范围内的DNA⽚段。
三种不同构型分⼦进⾏电泳时的迁移速度⼤⼩顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的⽤来进⾏⼤⽚段核酸的电泳，⾼浓度的⽤来进⾏⼩⽚段分析。
低浓度胶易碎，⼩⼼操作和使⽤质量好的琼脂糖是解决办法。
注意⾼浓度的胶可能使分⼦⼤⼩相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常⽤的缓冲液有TAE和TBE，⽽TBE⽐TAE有着更好的缓冲能⼒。
电泳时使⽤新制的缓冲液可以明显提⾼电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使⽤后，离⼦强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产⽣条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳⼀定要使⽤DNA Marker或已知⼤⼩的正对照DNA来估计DNA⽚段⼤⼩。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
3.冷却到60℃，加入2μl的1％ EB，并摇 匀，凝胶呈微红色即可。(EB剧毒！操 作时要戴上手套，）则为1.用溶解的琼脂糖将制胶板两端封好， （注意不可有缝隙。）插入适当梳子（ 注意调整梳子的高度，我个人的经验是 在托盘底面放一块厚0.5-1mm的薄片， 将梳子垂直插入，然后取走薄片。）。
琼脂糖凝胶电泳的工作原理及 操作
天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼 脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖 是从海藻中提出的一种线性高聚物。它 的分子结构分为一下两种。
D-半乳糖
3，6-脱水-L-半乳 糖
琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力 的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成 大网孔型凝胶。
琼脂糖电泳的一些优点
琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下： (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品 不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)， 近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳 小，对样品 吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性 好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直 接用紫外光灯监测及定量测定。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测 定。制成干膜可长期保存。
观察实验结果
正确的DNA上样量是条带清晰的保证。 注意太多的DNA上样量可能导致DNA带 型模糊，而太小的DNA上样量则导致带 信号弱甚至缺失
我们实验的 结果不清晰
10000 6000
40000
2000 1000 500 250
较清晰的的实验结果
注意事项
琼脂糖加热煮沸三次，完全溶解至无混 浊。 电泳缓冲液要高出胶板3-5mm。 倾倒胶板时小心，以防倒在梳子上。 点样时枪孔不能碰点样孔，防止破坏和 样品向周围扩散。 紫外分析时应调清晰对比度。
琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定
琼脂糖凝胶电泳：胶浓度与DN A长度的关系∙2010年1月22日∙1,527 views∙Biolog y∙没有评论分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表。
胶回收DNA注意事项①切胶回收DN A片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。
所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。
这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。
②主要还是DN A的浓度,如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。
③紫外灯下切下含待回收D NA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源DN A的污染。
④利用凝胶回收试剂盒DN A回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液p H太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。
⑤可以改用去离子水洗脱。
但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaO H 适当调高其pH值，以增加洗脱得率。
⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。
⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DN A完全洗脱下来。
⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。
如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。
琼脂糖凝胶电泳检测dna实验报告
琼脂糖凝胶电泳检测dna实验报告琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验报告。
实验目的，通过琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA分子的大小和数量，以验证DNA的提取和纯度。
实验材料与方法：1. 实验材料，琼脂糖凝胶、TAE缓冲液、DNA样品、DNA分子量标准品、电泳槽、电泳仪等。
2. 实验步骤：a. 制备琼脂糖凝胶，按照比例将琼脂糖和TAE缓冲液混合煮沸后倒入电泳槽中，待凝固后形成琼脂糖凝胶。
b. 样品处理，将待测DNA样品加入适量的载体溶液，并在65°C水浴中恒温30分钟。
c. 电泳操作，将处理后的DNA样品和DNA分子量标准品加载至琼脂糖凝胶孔中，进行电泳操作。
实验结果与分析：经过琼脂糖凝胶电泳检测，观察到DNA样品在电场作用下向阳极迁移，形成明显的DNA条带。
通过对DNA条带的位置和长度进行分析，可以初步判断DNA的大小和纯度。
同时，与DNA分子量标准品进行比对，可以更准确地确定DNA的分子量。
实验结论：本次实验通过琼脂糖凝胶电泳技术成功检测了DNA样品的大小和纯度，验证了DNA的提取和纯度。
实验结果为后续的分子生物学研究提供了重要的数据支持。
实验注意事项：1. 实验过程中需注意琼脂糖凝胶的制备和电泳操作的细节，保证实验结果的准确性。
2. 实验后要及时清洗和消毒实验器材，保持实验环境的整洁和卫生。
实验改进方向：1. 可以尝试不同浓度的琼脂糖凝胶和不同电泳条件，寻找更适合本实验的操作参数。
2. 可以尝试其他DNA检测技术，与琼脂糖凝胶电泳技术进行对比，寻找更准确、高效的检测方法。
总结：琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验是分子生物学实验中常用的技术手段，通过本次实验的学习和实践，对该技术有了更深入的了解，并为今后的科研工作打下了坚实的基础。
希望通过不断的实验探索和改进，能够为科学研究做出更大的贡献。
以上为琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验报告内容，如有不足之处，欢迎指正。
琼脂糖凝胶电泳实验报告
琼脂糖凝胶电泳实验报告一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中常用的技术之一，其目的主要包括以下几个方面：1、分离和鉴定 DNA 片段：通过电泳可以将不同大小的 DNA 片段在琼脂糖凝胶中按照分子量大小进行分离，从而能够直观地观察到DNA 样品的组成和纯度。
2、检测 DNA 的质量：通过观察电泳图谱中 DNA 条带的亮度、清晰度和完整性，可以评估 DNA 样品的质量，判断是否存在降解、杂质污染等情况。
3、定量分析 DNA 浓度：结合已知浓度的 DNA 标准品，通过比较样品条带与标准品条带的亮度，可以对 DNA 样品的浓度进行大致的估算。
二、实验原理琼脂糖是一种从海藻中提取的线性多糖聚合物。
当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，会形成网状的凝胶结构。
由于琼脂糖凝胶具有分子筛效应，DNA 分子在电场中会向正极移动，其迁移速度取决于 DNA 分子的大小和构象。
较小的 DNA 分子在凝胶中受到的阻力较小，迁移速度较快；较大的 DNA 分子受到的阻力较大，迁移速度较慢。
因此，不同大小的 DNA 分子在琼脂糖凝胶中会被分离成不同的条带。
在电泳过程中，通常使用溴化乙锭（EB）等荧光染料对 DNA 进行染色。
EB 能嵌入DNA 分子的碱基对之间，在紫外线照射下发出荧光，从而使 DNA 条带得以显现。
三、实验材料与设备1、实验材料DNA 样品：本次实验使用的是经过提取和纯化的λDNA 样品。
琼脂糖：选用高纯度的琼脂糖粉末。
电泳缓冲液：5×TBE 缓冲液（Tris硼酸EDTA），使用时稀释至1×TBE 工作液。
上样缓冲液（Loading Buffer）：含有甘油、溴酚蓝等成分，用于增加样品密度，便于样品沉入加样孔，并指示电泳进程。
核酸染料：溴化乙锭（EB）溶液。
2、实验设备电泳仪：提供稳定的直流电源，用于产生电场。
水平电泳槽：放置琼脂糖凝胶，容纳电泳缓冲液。
凝胶成像系统：用于观察和拍摄电泳结果。
DNA质量与浓度的琼脂糖凝胶电泳法测定试验原理
II. DNA质量和浓度的重要性
了解DNA样品的质量和浓度对于实验结果的准确性和可靠性至关重要，可帮助优化实验条件并确保数据的可 靠性。
III. 准备琼脂糖凝胶
详细介绍准备琼脂糖凝胶的步骤和注意事项，包括浓度选择、缓冲液配制和 凝胶浇注。
Hale Waihona Puke IV. 准备DNA样品描述准备DNA样品的步骤，如提取、纯化和测量DNA，以确保样品的可靠性和准确性。
V. 加载样品到琼脂糖凝胶上
指导将DNA样品加载到琼脂糖凝胶上的步骤，包括样品混合、电泳槽加载和 阳极与阴极的连接。
VI. 跑电泳
详细说明电泳条件的设置和运行，以及电场对DNA分离的影响，包括电压、 电流和电泳时间。
VII. 可视化DNA带
介绍如何使用染料和紫外线照射来可视化DNA在琼脂糖凝胶上的带状图案，并解释带状图案的含义。
DNA质量与浓度的琼脂 糖凝胶电泳法测定试验原 理 介绍琼脂糖凝胶电泳法（Agarose Gel Electrophoresis，AGE）的原理，以
及DNA质量和浓度的重要性。
I. 琼脂糖凝胶电泳法（AGE） 介绍
琼脂糖凝胶电泳法是一种常用的分离和分析DNA的技术，通过电场使DNA按 照大小分子量分离，并可用于检测DNA的纯度和浓度。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
二、DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。
1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系（1）DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。
但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。
此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。
（2）琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
表琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.12、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。
当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。
3、电泳方法（1）凝胶类型用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。
水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。
目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。
（2）缓冲液系统缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。
琼脂糖凝胶回收实验操作
琼脂糖凝胶回收实验操作及注意事项操作方案1.柱平衡：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，1200r，1min，倒废液，将吸附柱重新放回吸附管中。
2 切胶：配制琼脂糖EB凝胶,电泳以分离DNA片段。
推荐使用新鲜的TAE电泳缓冲液.不要重复使用电泳缓冲液,旧的电泳缓冲液PH会增加而降低DNA的回收产量;电泳足够时间后,在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来.并尽量去除多余的凝胶.注意:DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒,同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜.3.加等体积PN，50℃水浴：称取空离心管的重量,切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,求出凝胶块的重量,近似地确定其体积.一般情况下,凝胶的密度为1g/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算:凝胶薄片的重量为0.2g 则其体积为0.2ml;加入等倍凝胶体积的PN把混合物置于50℃水浴中温浴至凝胶完全融化,其间每隔2-3分钟混匀一次;小于300bp的小片段可完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶完全全溶后放置至室温在上柱，室温时结合DNA能力较强。
4.上柱：转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个吸附柱CA2中，,并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下放置2min,12000rpm离心1min,弃去液体.一个收集柱最多可容纳700μl的溶液,如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μl,可先转移700μl溶液至柱子,离心完后,将余下的溶液继续加上柱子上.但是每一个柱子最多可以结合25~30μg DNA.如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱中.5. 将柱子重新套回收集管中,加600μl PW 柱子中;室温下,12000rpm离心1分钟,弃废液;这一步相当关键,不要忽略此步.6.重复步骤57.将空柱子重新套回收集管中,12000rpm离心1min以甩干柱基质残余的液体.这步可以去除柱子基质上残余的乙醇,不要省略此步―――对得到好的DNA产量是十分重要的.8. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上,室温放置2min,12000rpm离心1分钟,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20度.如果再洗脱一次的话可以把残余的DNA洗脱出来,不过那样的浓度就会较低.DNA的产量及质量:把纯化产物的样品稀释一定的倍数后,分别在260nm和280nm下测其光吸收值,回收得到的DNA的浓度可按以下公式来计算: DNA浓度=光吸收260×50×稀释倍数μg/ml长度大于500bp的片段通常能纯化得到80%的产量. 而50bp~500bp的带则可达到55%~80%的回收率.(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸纯度的一个标记.如果此值1.8,则意味着核酸的纯度>90%.另一方面,如果纯化产物的产量较低时,可以用琼脂糖EB电泳估算产物的浓度.。
最新琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定
琼脂糖凝胶电泳浓度与d n a长度的确定琼脂糖凝胶电泳：胶浓度与DNA长度的关系•2010年1月22日•1,527 views•Biology•没有评论分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表。
胶回收DNA注意事项①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。
所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。
这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。
②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。
③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。
④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。
⑤可以改用去离子水洗脱。
但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH值，以增加洗脱得率。
⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。
⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。
⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。
如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。
⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
袱演芒厌弱磨箍溃蚁乙芹挝鸵亥圣龚引帐哪屹哺桔指致艳怕甭宰毫扎戊爸质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
（3）胶浓度 （4）电场强度：根据需要选择合适电压。 为了尽快得到实验结果，所用电场强度约为5V/cm， 但分辨率不高。 精确测定DNA分子大小时，电压1V/cm。 （5）溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂。
5、 DNA电泳的标准分子量（DNA Marker） 目前各厂商开发了各种类型的标准分子量。
室减减态夫载凹拆滚狼枢挠钎育酷支防趾兢让郊匈腰惺刘望垛件伴几变托质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
毛初市薪负龄硼吗植篡畸泪财础炬甩叭巍嫡锅旷恼疙戚煎八剧卵伺压快胀质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
3.0
500bp~1kb
500bp~1kb
4.0
100bp~500bp
6.0
10bp～100bp
抑殷上共缴袄鹃洱弥晾明柞稠硫雇淤剃柯溯山线经堰滨俩桅无国砌享裁竹质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
2、DNA电泳影响因素 主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。 （1）DNA分子大小 DNA分子越大在胶中摩擦阻力就越大，泳动也越慢， 迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 （2）DNA分子构型 相同分子量质粒DNA，构型不同电泳时受的阻力不同，泳动速率不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状次之，开环最慢。
实验二、DNA凝胶电泳
实验二、DNA凝胶电泳
二、琼脂糖凝胶电泳：
1．DNA分子大小：线性DNA分子在一定琼脂糖浓度内的迁移率与DNA分 子量的对数成反比。
2．琼脂糖浓度：小于0.5kb 的DNA片段所需的凝胶浓度为1.2-1.5%; 分离大于10kb 的DNA片段所需的凝胶浓度为0.3-0.7%; DNA片段大 小在两者之间的所需的凝胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子构象：对相同分子量的质粒DNA的三种构象，超 螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。
4．电源电压：在低电压时，线性DNA片段的移动速率与所 加电压成正比，但电压增高，不同分子量的DNA片段的移 动速率将以不同幅度增加；片段越大，升高的幅度也越 大。因此电压增高，琼脂糖有效分离范围将缩小。一般 所加电压不得超过5V/cm.
箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。 4、DNA分子量标准：
DNA/EcoR I/Hind III: DNA/EcoR I: 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和 2.5kb。 DNA/ Hind III: 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和 0.12kb.
实验二、DNA凝胶电泳
三、试剂： 1、5TBE缓冲液：Tris. 54g, 硼酸27.5g, 加入20ml
的0.5mol/L EDTA(pH8.0), 定溶至1000ml. 2、6上样缓冲液：0.25% 溴酚兰, 40%(w/v)蔗糖水溶液。 3、溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝
实验二、DNA凝胶电泳
实验二、DNA凝胶电泳
一、概述
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离和纯化DNA片段 的标准方法。其中，琼脂糖凝胶分离DNA片段大小范围较 广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的 DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNADNA通过实验掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的原理与方法。
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物（如下图所示）。
琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的凝胶。
琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一，这种方法简便易行。
而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装置中进行电泳，如果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。
琼脂糖凝胶的分离范围较广，选择不同凝胶浓度和装置，从50个碱基对到几兆不同长度的DNA都可以实现分离。
使用电场强度和电泳方向恒定的水平板琼脂糖凝胶电泳的方法，可以很好的分离长度在50-20,000 bp 的DNA片段。
DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响。
例如DNA分子的大小；琼脂糖的浓度；所加电压等等。
DNA片段越长，泳动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。
一个给定大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
用低浓度的荧光染料如溴化乙啶染色后，凝胶中的DNA可以直接被检测出来。
紫外灯下可以直接检测到20pg的双链DNA。
1.水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55?水浴；沸水浴；微量移液器（1）DNA样品；DNA标准分子量标记物；琼脂糖；1x电泳缓冲液TBE；6x样品缓冲液（2）溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。
将配好的10 mg/ml 溴化乙啶溶液装在棕色瓶中，室温保存，使用时稀释至0.5μg/ml。
缓冲溶液配制表缓冲溶液工作溶液储存溶液（每升） TBE 0.5x 5x0.045mol/L Tris-硼酸 54 g Tris 碱0.001mol/L EDTA 27.5g 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)0.2% 溴酚蓝储存温度4? 6x样品缓冲液50% (w/v) 蔗糖水液1. 照厂家说明准备好灌胶模具，置于水平面上（实验操作示意图如下）。
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琼脂糖凝胶电泳：胶浓度与DNA长度的关系
2010年1月22日
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Biology
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胶回收DNA注意事项
①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部
回收。
所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶
来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑
胶。
这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。
②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。
③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料
薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污
染。
④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的
片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴
时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将
其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高
盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。
⑤可以改用去离子水洗脱。
但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH值，以增加洗脱得率。
⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。
⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。
⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。
如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。
⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
关于胶回收切胶的一点注意事项
1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。
2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。
为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。
3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。
要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。
4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。
由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。
如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少
量的样，这样位置就容易确定了。
胶回收
一. 提高胶回收量的办法：
1) 增加电泳时的上样量。
2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。
3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。
4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。
5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。
6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA 分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。
最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。
9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。
10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。
二. 几种PCR 产物回收的详方法和步骤
1) 普通胶回收
如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。
另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。
2) 从低熔点凝胶回收DNA
纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl
pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。
待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下
层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。
反复1-2次。
取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。
将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。
3) 扩增特异性好的PCR回收
如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。
三. 不需胶回收就可直接连接的方法
1) 低温冷冻析出法
跑电泳时用低熔点的agarose胶，跑到一定时候，将目的条带所在的那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在负75度冰箱中10－30分钟，接着1，300rpm离心5－10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。
将其余的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－20度备用。
2) 酶切后的直接连接
在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的.
四、一些注意事项
1.电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。
2.切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。
为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。
3.关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果你戴树脂眼镜就可以了。
4.琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。
影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。
对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。
5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。
当然你要将100bp在胶中位置定好切下。
已标记的探针用X片，未标记的用EB。
6.选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。
7.参照分子克隆用低熔点胶回收。
除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。
附注：
1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
1)DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。
分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。
分子越大，迁移越慢。
等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）2) 琼脂糖浓度：logU=logU0 Krt 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。
不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA
Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb
1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.
3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。
当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。
4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm
5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃
6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)
7)电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，
1×TPE（均含EDTA pH8.0）。
2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。