实验十 血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定培训资料
谷丙转氨酶活力测定
谷丙转氨酶活力测定（改良赖氏法）一，实验目的掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ，也称谷丙转氨酶，GPT ）活性测定的原理。
熟悉转氨酶活性测定的操作方法。
了解测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的临床意义。
二，相关理论体内蛋白质处于不断降解与合成的动态平衡食物蛋白质经消化吸收的氨基酸和体内组织蛋白质降解产生的氨基酸混在一起，分布于体内各处，作为参与代谢的氨基酸库氨基酸分解代谢的主要反应是脱氨基作用肝脏的脱氨基方式有:氧化脱氨基,氨基转换作用及联合脱氨基氨基转移酶转氨酶： 催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT三．转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低 GOT 以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞 GPT 则以肝脏细胞中活力最大谷丙转氨酶的临床意义如果GPT 血清值超过正常上限2－3倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。
参考范围：0-50 U/L ，卡门氏单位0-25 KarU 四．酶活力单位（U ，active unit ）国际单位：61年酶学委员会建议使用统一单位，在特定条件下，1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU ，又称U ）1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm ，光径1cm 的条件下，1ml 血清使反应液的吸光度下降0.001的转氨酶活性。
卡门氏单位和国际单位换算1 IU/L ＝2.1 KarU 五，实验原理血清中的丙氨酸转氨酶（ALT ），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT 活性的高低成正比关系。
血清谷丙转氨酶的测定(“实验”相关文档)共6张
学会谷丙转氨酶(ALT)活力测定方法
37℃水浴保温30min
37℃水浴保温30min
丙酮酸+2,4-二硝基苯胺——〉丙酮酸2,4-二硝基苯腙
丙酮酸氨基转移酶基质液
丙酮酸+2,4-二硝基苯胺——〉丙酮酸2,4-二硝 丙酮酸+2,4-二硝基苯胺——〉丙酮酸2,4-二硝基苯腙
10min后测A520
基苯腙 丙酮酸氨基转移酶基质液
规范管
血10清mi谷n后丙测转A氨52酶0的测样定 本
——
——
丙酮酸氨基转移酶基质液
学会谷丙转氨酶(ALT丙)活酮力测酸定钠方规法 范 ——
0.1
丙酮酸氨基转移酶基液质液
10min后测A520
丙酮酸+2,4-二硝基苯丙胺—酮—酸〉氨丙酮基酸转2,4-二硝0基.5苯腙
0.5
学会谷丙转氨酶(ALT移)活酶力测基定质方液法
37℃水浴保温30min
10min后测A520
37℃水浴保温30min
丙酮酸+2,4-二硝基苯胺——〉丙酮酸2,4-二硝基苯腙
丙酮酸氨基转移酶基丙质液酮酸氨基转 0.5
0.5
移酶基质液
37℃水浴保温20min
碱性溶液
5.0
5.0
10min后测 A520
测定管 0.1 —— 0.5
0.5
5.0
计算：
血清谷丙转氨酶的测定
[实验目的及要求]
学会谷丙转氨酶(ALT)活力测定方法
[实验原理]
10min后测A520
37℃水浴保温30min
丙氨酸+α-酮戊二酸 丙酮酸+ 丙酮酸氨基转移酶基质液
血清谷丙转氨酶测定
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COOH
C NH2 CH3 Ala
COOH
COOH
谷丙转氨酶
+ CO
CO
(CH2)2
CH3
COOH
丙酮酸
α-KG
COOH + C NH2
(CH2)2 COOH
Glu
NO2
COOH CO
+ H2N
HN
NO2
CH3
2，4-二硝基苯肼
0
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COOH
NO2
C N HN
CH3
NO2
丙酮酸-2，4-二硝基苯腙 棕红色，520nm处具特征光 吸收，颜色深浅（OD520值） 与丙酮酸含量成正比，可据
transaminase GOT
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–当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿
胀、坏死导致大量的酶释放到血流中，从而引起血清谷
丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶(GOT)活性显著升高。因
此测定这些酶的活性对某些疾病的临床诊断具有重要的
参考价值。
本试验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物 (基质液 成分)经血清谷丙转氨酶作用生成谷氨酸及丙酮酸。丙
28
57
97
150 200
2,4-二硝基苯肼 ml
0.50 0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
37℃水浴保温 20min
氢氧化钠 ml
5.0 5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
室温下静置10min
0号管调零，于520nm处测吸光度
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GPT活力测定：洁净干燥试管2支， 即测定管、对照管各1支
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四、实验操作
血清谷丙转氨酶ALT(精)
光度。由测得的吸 A 光度在曲线上查得
试样溶液中待测组
分的浓度，最后计
算得到试样中待测
组分的含量。
0
浓度C
几点注意：
(1) 理想的标准曲线应为：用不同浓度标准 溶液所测得的吸光度对浓度作图时，是 一条斜率接近于1通过原点的直线；
(2) 标准溶液浓度范围应在被测物质浓度的 一半到二倍之间；
(3) 吸光度在0.05---1.0之间为宜。
A样 = KC样L
A标
KC标L
则：
C样 =
A样 A标
C标
2. 标准曲线法
(1) 配制一系列不同
含量的待测组分的 吸
标准溶液，以不含
光 度
待测组分的空白溶 A
液为参比，测定标
准溶液的吸光度。
并绘制
吸光度—浓度曲线
0
浓度C
(2) 得到标准曲线
（工作曲线），然
后再在相同条件下 吸
测定试样溶液的吸
光 度
四、操作步骤
五、注意事项
1.血清样品的测定需在显色后30分钟内完 成。
2.在血清中加入底物后，应准确记时。
பைடு நூலகம்
六、实验的结果
• 1.第一组同学绘制标准曲线 • 2.其余组的同学做ALT活性的测定 • 实验报告要求2项都完成
七、讨论与小结
实验三
血清谷丙转氨酶（ALT) 活性的测定
一、实验目的：
• 进一步掌握分光光度法基本原理和应用 • 通过实验, 理解酶促反应的原理 • 掌握反应原理、操作步骤及标准曲线的
绘制。
二、原 理
三、方法
分光光度法----标准曲线法
定量分析方法
1. 对比法
将标准与样品分别在相同条件下显色，测 定其吸光度。因是相同物质在相同条件下 测定，故可按下式计算出样品的浓度：
实验十 血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定
实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线二、测酶活力和总结。
或就做二就可以）【目的和要求】1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。
3、熟悉分光光度计的使用。
【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。
转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。
它们催化的反应如下。
正常人血清中只含有少量转氨酶。
当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。
谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。
从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。
【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。
现用现配。
2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。
然后用1M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。
9 血液中转氨酶活力的测定
实验九&十血液中转氨酶活力的测定（分光光度法）本实验八人一组（根据分光光度计来确定）一、目的要求：1、了解转氨酶的重要作用及其在临床诊断中的意义。
2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。
二、原理：（谷丙转氨酶和丙酮酸的反应方程式）生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基与丙酮酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。
转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类很多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。
正常人血清中只含有少量转氨酶，当发生肝炎、心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
本实验采用分光光度计法。
谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙（催化反应方程式）。
丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法（520nm）测定。
从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可以计算酶的活力。
三、操作：实验九标准曲线的绘制（由于时间关系，只做一组数据，不要重复）1、向试管中加入试剂（有改动）：取6支试管，分别标上0、1、2、3、4、5六个号。
按表中所列的次序添加各种试剂（由于后面测定样品时有对照实验，所以不需要加入谷丙转氨酶底物，以蒸馏水补齐；不需要保温10分钟来平衡内外温度）。
2、向各管内加入0.5mL 2，4—二硝基苯肼溶液后37℃保温20分钟。
3、分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5mL（丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色）。
在室温下保温静置30分钟，以0号管做空白，测定A520nm的吸光度。
用丙酮酸的摩尔数做横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。
实验十酶活力的测定一、目的要求：2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。
二、原理：（谷丙转氨酶和丙酮酸的反应方程式）本实验采用分光光度计法。
生物化学实验谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定一、[实验目的]1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。
二、[仪器与试剂]1．实验材料动物肝脏2．实验试剂（1）0.9%NaCl溶液（2）海砂（3）1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）（4）1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）（5）0.1%KHCO3溶液（6）0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）（7）2%乙酸溶液（8）酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水（按重量计算）混合，放入分液漏斗中，振荡。
静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。
新配制的酚展层剂可以反复使用1周。
（9）0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液（10）0.1%标准谷氨酸溶液（11）0.1%标准丙氨酸溶液（12）1%KOH溶液谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）一、[实验原理]观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。
通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。
为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。
二、[实验操作]1.谷丙转氨酶提取液制备：2g肝脏+0.9%NaCL 6mL+海砂 200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。
2.转氨作用取试管2支，按下表加入试剂，加入试剂的单位为mL加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析3.纸层析操作方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。
用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色。
血清谷-丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法)
将采集的血清样本进行适当的处理，如离心、过滤等，以去 除杂质和分离出血清部分。
实验操作步骤
实验操作
按照实验步骤，逐步进行实验操作，包括加样、反应、比色等。
实验记录
在实验过程中，详细记录实验数据和结果，以便后续的数据分析和处理。
04
结果分析
数据记录
总结词：准确记录
详细描述：在测定过程中，应准确记录每个步骤的数据，包括样本编号、试剂用 量、反应时间、温度等，以确保结果的准确性和可追溯性。
THANKS
感谢观看
05
实验结论
数据总结
实验数据
通过改良赖氏法测定，得到各样本的血清谷-丙转氨 酶活性数据。
数据处理
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、变 异系数等。
数据可靠性
确保实验数据的准确性和可靠性，排除异常值和离群 点。
实验结论
正常参考值范围
根据实验数据，确定正常参考值范围，为临床 诊断提供依据。
结果计算
总结词：科学计算
详细描述：根据实验原理和公式，对实验数据进行科学计算，得出谷-丙转氨酶的活性值。计算过程需注意单位的统一和数值 的精度。
结果解读
总结词：综合分析
详细描述：结合患者病情、肝功能其他指标以及肝功能检查的历史数据，对谷-丙转氨酶活性测定结果 进行综合分析，判断肝脏功能状况，为临床诊断和治疗提供依据。
通过加入溴代十六烷基三甲胺，可以减少反应 液中其他酶对谷丙转氨酶活性测定的干扰，提 高测定结果的准确性。
实验注意事项
实验前应确保血清样本无溶血、黄疸或脂血现象，以免影响测定结果。 实验过程中应严格控制反应温度和时间，以确保反应完全和测定结果的准确性。
在测定过程中应避免接触有毒物质，如重氮基苯磺酸铵等，以免对健康造成危害。
谷丙转氨酶活性检测
4℃保存。 ⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即
为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。
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5
2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）
取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为5批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。
8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管
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七、酶活性单位的定义
* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm
30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
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六、临床意义
化验介绍:
正常时，谷－丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞 含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所 以血清中此酶活力很低。
当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各 种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此 酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。
的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。 * 国际单位：在最适温度（25℃）下，1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1 个活性单位，即1IU=1umol/min。
10转氨酶测定
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4二硝基苯腙（黄色），进而在碱性环境中生成 红棕色的苯腙硝醌化合物。
其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成 量，亦即与GPT活力的高低成正比关系。据此 与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出 或通过标准曲线查出血清中GPT的活力。
0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2.0μ mol/mL 丙酮酸标准溶液 谷丙转氨酶底物 2,4-二硝基苯肼溶液 0.4mol/L 氢氧化钠溶液
【操作步骤】
1.标准曲线的制作
管号 试剂/mL
丙酮酸钠 标准液 基质液
磷酸缓冲液
丙酮酸含量 (umol)
0 12 3 45
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
按上表编号及加入试剂。加毕，摇匀，置37℃ 恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管 加入0.5mL 2,4-二硝基苯肼溶液后再保温20min。 取出后向各管加入0.4mol/L NaOH溶液5mL。室 温下静置10min，以零号管作对照,于520nm波长 处测定各管光吸收值。以丙酮酸的umol数为横 坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。
血液中转氨酶活力的测定（分光光度法）
【实验目的】
1.掌握转氨酶活力测定的原理和方法。 2.了解血清谷丙转氨酶活力测定的临床意义。
【实验原理】
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用 分光光度法。血清中的谷-丙转氨（GPT）， 在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物） 液中的丙氨酸与α -酮戊二酸生成谷氨酸和丙 酮酸：
血清谷丙转氨酶的测定实验报告
一、实验目的1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用。
2. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。
3. 掌握分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的操作技能。
二、实验原理转氨酶是一种广泛存在于生物体内的氨基转移酶，能催化氨基酸的氨基与酮基酸的酮基互换。
在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。
其中，谷丙转氨酶（ALT）是人体内最重要的转氨酶之一，主要存在于肝脏细胞内。
当肝脏发生病变时，如肝炎、心肌梗死等，血清中ALT活力常显著增加，因此在临床诊断上，ALT活力的测定具有重要的意义。
本实验采用分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力，通过检测ALT催化丙氨酸与酮戊二酸反应生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，来计算酶的活力。
三、实验材料1. 仪器：分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、试管等。
2. 药品与试剂：丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、NaOH、标准ALT溶液、血清样本等。
四、实验步骤1. 准备工作：将所有药品与试剂按照实验要求进行配置，确保实验所需的药品与试剂质量合格。
2. 标准曲线制作：将标准ALT溶液按照实验要求进行稀释，制成一系列不同浓度的标准溶液。
分别取等体积的标准溶液和2，4-二硝基苯肼溶液，混合后加入NaOH，进行显色反应。
在560nm波长下，测定吸光度值，以ALT浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 实验测定：取血清样本，按照实验要求进行稀释，分别加入丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼和NaOH，进行显色反应。
在560nm波长下，测定吸光度值。
4. 数据处理：将实验测定的吸光度值代入标准曲线，计算出血清ALT活力。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，线性范围为20～100U。
2. 实验测定：根据实验数据，计算血清ALT活力，结果为X U/L。
3. 结果分析：根据血清ALT活力值，判断肝脏功能是否正常。
血清谷丙转氨酶活力测定
血清谷丙转氨酶活力测定目的和要求了解转氨酶的性质及临床意义。
掌握用测定试剂盒方法测定谷丙转氨酶（GPT或ALT）活力。
原理在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。
此过程可用下式表示：本实验以丙氨酸的氧化脱氨为例，测定谷丙转氨酶活性。
在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α–酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。
此反应可逆，平衡点近于1。
无论正向或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可测定生成的α–酮酸，因此可有多种测定方法。
本实验以丙氨酸及α–酮戊二酸作为谷丙转氨酶（GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。
丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸–2，4–二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439～530nm，可用于测定丙酮酸含量。
α–酮戊二酸也能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯稍有差别，在520nm波长比色时，α–酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。
经转氨酶作用后，α–酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α–酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以籍以测定谷丙转氨酶的活力。
但是，由于在实验中不宜有过多的α–酮戊二酸以降低其对显色的干扰，因此，对于作为底物的α–酮戊二酸浓度作了一定的限制，从而不能保证酶反应充分进行，以致丙酮酸产量与酶之间的关系并不始终成一直线关系。
当酶量增大时，曲线斜率减小。
因此在测定时，如酶活力较大（大于100单位），应将样品稀释后再进行测定。
另外，2，4二硝基苯肼对此显色反应也有一定的干扰，因此，在制作丙酮酸标准曲线时，虽没有加α–酮戊二酸，但是丙酮酸二硝基苯腙的吸光度与丙酮酸含量之间的关系也并不始终呈一直线关系，丙酮酸含量增大时，曲线斜率降低，因此，必须采用标准曲线中呈现出直线关系的部分来测定丙酮酸的生成量。
实验十_血清转氨酶的活性测定
血清转氨酶的活性测定一、实验目的1、了解分光光度计的使用方法2、了解血清ALT测定方法的原理二、实验原理1、转氨基作用指的是一种氨基酸alpha-氨基转移到一种alpha-酮酸上的过程。
转氨基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。
其实可以看成是氨基酸的氨基与alpha-酮酸的酮基进行了交换。
结果是生成了一种非必需氨基酸和一种新的alpha-酮酸。
反应由转氨酶和其辅酶磷酸吡哆醛催化。
磷酸吡哆醛是维生素B6的衍生物。
人体内最重要的转氨酶为谷丙转氨酶和谷草转氨酶。
它们是肝炎诊断和预后的指标之一。
2、转氨酶活力的测定ALT作用于丙氨酸及α-酮戊二酸基质，反应生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸可以与2，4-二硝基苯肼定量反应生成丙酮酸苯腙，在碱性条件下呈红色，可以用分光光度法定量检测(500nm)。
三、实验器材、试剂1、仪器723型分光光度计2、试剂0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4)，ALT底物液(含丙氨酸(过量)，α-酮戊二酸)、2，4-二硝基苯肼溶液，0.4mol/LNaOH溶液，2umol/L丙酮酸标准液。
四、实验步骤1、标准曲线的绘制按下表操作试剂/mL对照1234丙酸酮标准液00.150.30.450.6ALT底物0.60.450.30.1500.1mol/L磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.1置37℃水浴5min，各管加2，4-二硝基甲苯溶液1ml，混匀，再在37℃水浴放置20min，各管加0.4mol/L氢氧化钠2ml，混匀，10min后，以对照组调零测A500.以各管吸光度为横坐标，以相应的ALT单位为纵坐标绘制标准曲线。
3、血清ALT的测定按下表操作试剂/ml测定对照血清0.10.1ALT底物液0.6---置于37℃水浴加热30min2，4-二硝基甲苯11ALT底物液---0.6置37℃水浴20min，各加入0.4mol/L的氢氧化钠2ml，混匀，10min后，以对照组调零，测A500。
血清谷丙转氨酶活性的测定
【方法学评价 】
2.准确性差：线性范围狭窄,尽管标本采用稀释 后测定,但偏差仍较大。
3.试剂稳定性差 4.操作简单
【临床意义】
肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾 病致肝细胞受损伤时，ALT即大量释放入血 液，致使血清中ALT活性增高。测定ALT是 检查肝功能的重要指标之一。
1.ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中 毒性肝细胞坏死。
【操作步骤】
（2）校正曲线的制备
加入物(ml)
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷酸盐缓冲液
0.1
0.1
0.1
0.1Biblioteka 0.12.0mmol/L丙酮酸标准液 基质缓冲液
0
0.05 0.10 0.15 0.20
0.50 0.45 0.40 0.35 0.30
1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液 0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
混匀，37℃保温20min
0.4mol/L NaOH溶液
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
卡门单位
0
28
57
97
150
混匀，室温放置5min，在波长为505nm处比色，蒸馏水调“0”
取7支试管，按下表操作
卡门单位 加入物(ml)
血清 基质缓冲液
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液
2
3
4
0.1 0.1 0.1 0.10 0.15 0.20 0.40 0.35 0.30 0.5 0.5 0.5
5.0 5.0 5.0
混匀，室温放置5min，在波长为505nm处比色，蒸馏水调“0”
血清谷丙转氨酶活性的测定
实验内容和步骤
1) 制备标准曲线
2) 绘制标准曲线
以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横 坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对 应的酶活性单位数的标准曲线。
4) 2，4－二硝基苯肼（1mmol/L）
称 2，4－二硝基苯肼 20mg。先溶于 10mL 浓盐 酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。
5) 丙酮酸标准液
精确称取丙酮酸钠 22mg。加磷酸缓冲液溶解后 定容至 100mL。此溶液浓度为 2μ mol/mL，临用前 配制。 0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸 缓冲液（pH7.4）。
6) 血清转氨酶活性高于 500（U）/100mL 血清时，应将血清稀释一定倍数重新测定， 其结果应乘以稀释倍数。
7) 每次测定样品数不要太多，其数量以在显色后 30min 内完成比色为宜。
血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生 加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境
中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范 围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关
4) 转氨酶只能作用于α －L－氨基酸（L－天冬氨酸，L－丙氨酸），对 D－氨基酸无催 化作用。实验室多用α －DL 氨基酸（因较 L－氨基酸价廉），如采用α ―L―氨基酸, 则需按α －DL 氨基酸的用量减半。
5) 为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定 PH，保温时间，选用固定的比色计，比 色杯以减少误差。
实验十一 谷丙转氨酶活性的测定
A.取干净试管6支，编号后按照下表添加试剂。 B.将试管置于37℃水浴中保温10min，然后向每管中加入0.5ml2,4-二 硝基苯肼，再继续保温20min。 C.分别向各管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温下静止10min。 D.用“0”号管作为空白对照，与520nm下测定吸收值。 E.以各管吸收值为纵坐标，丙酮酸的浓度为横坐标做标准曲线。
应
用
• GPT在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏早晨损害或病 毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损，GPT就释放到血液 中，使血清中此酶水平明显要指标。
实验方法
1.标准曲线的制备
0 2mM丙酮酸标准溶液 （ml） 磷酸缓冲液（ml） GPT底物溶液（ml） 0.00 0.25 0.50 1 0.05 0.20 0.50 2 0.10 0.15 0.50 3 0.15 0.10 0.50 4 0.20 0.05 0.50 5 0.25 0.00 0.50
2、严格按照实验步骤进行，温度和时间均要严格控制。
2.GPT活性的测定：取干净试管4支，按照下表添加试剂。
试剂
鱼肌肉匀浆液（ml） GPT底物溶液（ml）
测定1
0.25 0.50
对照1
0.25
测定2
0.25 0.50
对照2
0.25
37 ℃水浴加热30min（转氨基反应） 2,4-二硝基苯肼（ml） GPT底物溶液（ml） 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
37 ℃水浴加热20min（丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应） 0.4mol/L氢氧化钠溶液 （ml） 5.00 5.00 5.00 5.00
各管反应完成后混匀，室温静止10min后，以对照管1或者对照2调 节零点，测定1和2号管的吸收值。
谷丙转氨酶活性的测定
操作步骤
三.GPT活力的测定 1.取3支试管，标记后按表2加入溶液 ml
试剂 磷酸盐缓冲液 GPT基质液 血清 2,4-二硝基苯肼 0.1 0.1 0.02 （混匀后 37 度 保温20min） 1 1 1 空白管 0.02 0.1 对照管 样品管
0 . 1 （ 3 7 度保温 0.1 30min)
试剂与器材
分光光度计 水浴锅
血清
NaoH溶液
1.试剂 0.1mol∕L 磷酸盐溶液 GPT基质液 2,4-二硝 基苯肼溶液 2μmol/ml的丙酮酸标准液 75%的乙醇 2.器材 烧杯 移液管 胶头滴管 容量瓶 玻璃棒 比色 杯 电子天平 试管及试管架 洗耳球等
操作步骤
一.血清的提取 1.电子天平称量小鼠体重，用75%的乙醇按一定比例对小鼠进 行灌胃。灌胃时要紧贴上颌，将针头轻轻旋入胃中，一边观 察小鼠精神状态一边缓缓注入一定体积的乙醇。 2.24h后，摘除小鼠眼睛，于眼部取血至离心管。 3.3500r∕min 离心5分钟，用移液枪移去上清液到另一离心 管，离心2次。
实验结果
实验数据记录-表3
试管号
1
2
3
4
5
6
丙酮酸标 准 液 0 （ 2 μmol/ ml）
吸光值 0
0.05ml
0.10ml
0.15ml
0.20ml
0.25ml
0.069
0.177
0.200
0.282
0.355
实验结果
实验结果
实验数据-表4
空白管 对照管 样品管
吸光值
0.329
0.005
0.278
0.02 0.1
血清
血液中转氨酶活力的测定(分光光度法)
1
0.5 置于37℃水浴内预热5分钟
2
0.5
人血清
2,4－二硝基苯肼溶液 人血清
0.1
0.5 －
－
0.5 0.1
振摇均匀，置于37℃水浴内继续保温60分钟
氢氧化钠溶液
A520nm
5
5
0
充分摇匀，室温下静置30分钟后，以2号管作空白，520nm处比色
在标准曲线上查出丙酮酸的μ mol数（用1μ mol丙酮酸代表1.0单位酶 活力），计算每100 mL血清中转氨酶的活力单位数。
各管摇匀，置于37℃恒温水浴锅预热5-10分钟 各管摇匀，置于37℃恒温水浴锅加热20分钟
充分摇匀，室温下静置30分钟后，以0号管作空白，520nm处比色
用丙酮酸μ mol数为横坐标，光吸收值A520nm为纵坐标，画出标准曲线。
2．酶活力的测定
取2支干洁试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对 照管。按下表操作。 试剂（ml） 谷丙转氨酶底物 试 管 号
血液中转氨酶活力的测定（分光光度法）
一、目的 1.了解转氨酶在代谢过程中的重要作用； 2.学习转氨酶活性测定的基本原理和操作方法； 3.了解转氨酶活性测定的临床意义。
二、原理
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α 氨基酸的α -氨基与α -酮酸的α -酮基互换，在氨基酸的合成 和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用 。 转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草 酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶 （简称谷丙转氨酶）的活力最强。
思考题： 转氨酶在代谢过程中的重要作用及在临床诊断中的意义？
参考答案： 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α 氨基酸的α -氨基与α -酮酸的α -酮基互换，在氨基酸的合成和 分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。 肝细胞中含转氨酶最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤 时，转氨酶即大量释放入血液，致使血清中转氨酶活性增高。 测定转氨酶是检查肝功能的重要指标之一。转氨酶显著增高见 于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于 肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于阻塞性 黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨 酶活性升高。
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实验十血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的
测定
实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定
（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）
（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线二、测酶活力和总结。
或就做二就可以）
【目的和要求】
1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，
2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。
3、熟悉分光光度计的使用。
【原理】
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。
转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转
氨酶）的活力最强。
它们催化的反应如下。
正常人血清中只含有少量转氨酶。
当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。
谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。
从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。
【试剂和器材】
一、试剂
1.试管及试管架
2.吸管
3.恒温水浴
4.分光光度计
5、移液管
6、电子天平
7、研钵
8、容量瓶
9、冰箱
二、器材
1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M
的PBS中，定容到100ml。
现用现配。
2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。
然后用1
M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。
3、0.1mol/L pH7.4 PBS：称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml。
4、0.02% 2.4-二硝基苯肼溶液：称取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L HCl中。
把锥形瓶放在
暗处并不时摇动（或加热溶解），待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，用1mol/L HCl定容到100ml。
滤入棕
色玻璃瓶内置 [冰箱内保存]。
5、0.4mol/L NaOH：称取16g NaOH定容到1000ml。
6、0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl，定容
到100ml。
【操作方法】
一、标准曲线的给制：取6支试管，分别标上
0，1，2，3，4，5六个号。
按下表所列的次
序添加各试剂。
2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用
形成苯腙。
底物中的α-酮戊二酸与2，4-二
硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。
因
此，在制作标准曲线时，须加入一定量的
底物，（内含α-酮戊二酸）以抵消由α-酮
戊二酸产生的消光影响。
先将试管置于37℃恒温水浴中保温
10min以平衡内外温度。
向各管内加入
0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保温
20min，最后，分别向各管内加入0.4mol/L
氢氧化钠溶液5ml。
在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。
用丙酮酸的微摩尔
数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。
（总图如下）
二、谷丙转氨酶活力的测定（学生只做这个）
1、样品的制备（集体制备）
将鸡处死，取肝脏后用生理盐水冲洗，滤纸吸干后，称取0.5g 肝脏，剪成小块，加入预冷（冰水或冰箱中）的pH7.4的PBS 4.5ml，在冰水浴中制成10%的匀浆， 4000rpm冷冻离心10分钟后保存在
冰水中备用。
（一组按10ml算：10ml*N）
2、酶活力的测定：
取6支试管，按下表操作：
测定管（A）标准管（S）对照管（B）空白管谷丙转氨酶底物（ml）0.5 0.5
37℃水浴5min
肝匀浆（或血清）
0.1 丙酮酸0.1ml 0.1 水0.1ml
（ml）
3、计算：每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位：
D=(A-B) ×500/S×2.5=(A-B) ×200/S
D:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml)
式中 A:样品管吸光度值
B:对照管吸光度值
S:标准管吸光度值
500:标准丙酮酸溶液
2.5浓度谷丙转氨酶的换算单位系数
【注意事项】
1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37℃水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。
2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过500U时，需将样品稀释。
3. 转氨酶只能作用于α－L－氨基酸，对D－氨基酸无作用。
实验室多用α－DL－氨基酸（较L－氨基酸价廉），若用L－氨基酸，则用量减半。
4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。
5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。
6．酶在37℃下与底物作用30min后，以能产生2.5μg的丙酮酸为一个活力单位。
7．α-酮戊二酸也能产生苯腙，但在520nm下远较丙酮酸的低。
8．α-酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼对显色有一定干扰，注意添加量
琼州学院实验项目卡
生命科学系生化实验室开设日期____年___月___日
实验教师签名______________________ 实验员（管理员）签名______________。