高效液相色谱定性定量分析方法==共55页文档
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱分析
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
2020/2/10
第三章 高效液相色谱
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-3 §3-4 液相色谱的固定相 液相色谱的流动相
stationary phase and mobile phase of HPLC
2020/2/10
HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
2020/2/10
第三章 高效液相色谱
2020/2/10
二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对 离子；
反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有 对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入 流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。
2020/2/10
五、离子色谱
ion chromatography
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一项技术，其 与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术 和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
2020/2/10
第三章 高效液相色谱
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-3 §3-4 液相色谱的固定相 液相色谱的流动相
stationary phase and mobile phase of HPLC
2020/2/10
HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
2020/2/10
第三章 高效液相色谱
2020/2/10
二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对 离子；
反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有 对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入 流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。
2020/2/10
五、离子色谱
ion chromatography
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一项技术，其 与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术 和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
高效液相色谱分析ppt课件
• 分离极性物质，选用极性固定液，各组分按极性顺序分 离，极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱。
• 分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液，这 时非极性组分先出峰。
• 对于形成氢键的试样，如醇、酚、胺和水等，一般选用 极性或氢键型固定液，各组分按与固定液分子间形成氢 键能力大小先后出峰。
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/10/28
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
速率理论(与GC对比)
• GC: HAB/uCu(填充)柱 HAB/uCu (毛细管) 柱
A2dp Adp B2Dm2Dg BtR, BDg
DgT或Dg T
η
M
CCmCs Cg Cl Cl
df2
T
Cl Dl
DL
• HPLC: HACu
3、离子色谱装置类型 suppressed apparatus of IC
抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05
毫摩尔/克干树脂。 非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～ 0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸 及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接 与分离柱相连，不需抑制柱。
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
• 分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液，这 时非极性组分先出峰。
• 对于形成氢键的试样，如醇、酚、胺和水等，一般选用 极性或氢键型固定液，各组分按与固定液分子间形成氢 键能力大小先后出峰。
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/10/28
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
速率理论(与GC对比)
• GC: HAB/uCu(填充)柱 HAB/uCu (毛细管) 柱
A2dp Adp B2Dm2Dg BtR, BDg
DgT或Dg T
η
M
CCmCs Cg Cl Cl
df2
T
Cl Dl
DL
• HPLC: HACu
3、离子色谱装置类型 suppressed apparatus of IC
抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05
毫摩尔/克干树脂。 非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～ 0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸 及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接 与分离柱相连，不需抑制柱。
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
高效液相色谱法定性定量分析.正式版PPT文档
应用范围
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥 发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不 同极性的有机化合物；生物活性物质和多种 天然产物；合成的和天然的高分子化合物等 。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物 、生物化工产品及环境污染物等，约占全部 有机化合物的80％。其余20％的有机化合 物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等 分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分 析。
进样器
进样器： 目前采用较多的是六通
进样阀和自动进样器。 对进样装置的要求：
密封性好，死体积小， 重复性好，保证中心进样， 进样时对色谱系统的压力、 流量影响小。 进样方式可分为：
隔膜进样、停流进样、阀进 样、自动进样。目前应用做多的 是阀进样和自动进样。
色谱柱
色谱柱的要求：
柱效高、选择性好，分析 速度快等。市售的用于HPLC的 各种微粒填料好多孔硅胶以及以 硅胶为基质的键合相、氧化铝、 有机聚合物微球(包括离子交换 树脂)、多孔碳等，其粒度一般 为3，5，7，10μm等，柱效理 论值可达5～16万/米。对于一 般的分析只需5000塔板数的柱 效;对于同系物分析，只要500 即可;对于较难的分离物质对则 可采用高达2万的柱子，因此一 般10～30CM左右的柱长就能 满足复杂混合物分析的需要。
数据记录及处理
目前对于数据记录及处理所采用的是计 算机，计算机的广泛应用使得HPLC操作更 加迅速，简便，准确，精密和自动化，现在 已经可以在互联网上远程处理数据，目前计 算机在HPLC上的用途主要由： 1. 采集处理和分析数据； 2. 控制仪器； 3. 色谱系统优化和专家系统。
HPLC的固定相和流动相
检测器
色谱系统优化和专家系检统。 测器是HPLC系统的三大关键部 件之一，作用是把洗脱液中的组分的量 市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，
高效液相色谱分析法-资料
– 在作正相洗脱时，流动相的极性增大，洗脱 能力增加，k减小，tR减小；反之k与fR增大。
– 分离结构相近的组分时，极性大的组分后出 柱。
2019/11/13
续前
流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓
出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱
适用： • 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）
分离物质也相似 • 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性
分析极性大物质、糖类等
2019/11/13
（三）离子对色谱法：
• 离 于 对 色 谱 法 (pairedIOnchromatography ， PIC 或loripairchromatography，IPC) ，反相离子对 色谱法(RPIC)． – 反相离子对色谱法是把离子对试剂加入极性 流动相中，被分析的样品离子在流动相中与 离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子 对(离子对模式说)，从而增加了样品离子在 非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加， 改善分离效果。
2019/11/13
三 其他高效液相色谱法
一)离子色谱法(Ion Chromatography,简称IC)
以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析 对象, 在七十年代出现、八十年代迅速发展。
• 传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问 题：
• (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； • (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测
第二十章 高效液相色谱分析法
high performance liquid chromatograph
一、高效液相色谱法的主要类型 和原理 二、高效液相色谱法的固定相和 流动相及其选择 三、高效液相色谱仪
– 分离结构相近的组分时，极性大的组分后出 柱。
2019/11/13
续前
流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓
出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱
适用： • 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）
分离物质也相似 • 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性
分析极性大物质、糖类等
2019/11/13
（三）离子对色谱法：
• 离 于 对 色 谱 法 (pairedIOnchromatography ， PIC 或loripairchromatography，IPC) ，反相离子对 色谱法(RPIC)． – 反相离子对色谱法是把离子对试剂加入极性 流动相中，被分析的样品离子在流动相中与 离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子 对(离子对模式说)，从而增加了样品离子在 非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加， 改善分离效果。
2019/11/13
三 其他高效液相色谱法
一)离子色谱法(Ion Chromatography,简称IC)
以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析 对象, 在七十年代出现、八十年代迅速发展。
• 传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问 题：
• (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； • (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测
第二十章 高效液相色谱分析法
high performance liquid chromatograph
一、高效液相色谱法的主要类型 和原理 二、高效液相色谱法的固定相和 流动相及其选择 三、高效液相色谱仪
高效液相色谱分析精品文档
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-2 主要分离类型与原理
basic principle and main separating types
一、液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatograph
二、液-固吸附色谱
一、液相色谱固定相
stationary phase of HPLC
二、液相色谱流动相
mobile phase of HPLC
三、分离条件的选择
2019/10/26
一、液相色谱固定相
stationary phases of LC
1. 液-液分配及离子对色谱法固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
2019/10/26
第三章 高效液相色谱
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-1 概述
பைடு நூலகம்
一、高效液相色谱法特点
Characteristic of HPLC 二、影响色谱峰扩展及分离的因素
The factors that influence peak expansion and sepration
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/10/26
2019/10/26
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因 子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/10/26
high performance liquid chromatograph
§3-2 主要分离类型与原理
basic principle and main separating types
一、液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatograph
二、液-固吸附色谱
一、液相色谱固定相
stationary phase of HPLC
二、液相色谱流动相
mobile phase of HPLC
三、分离条件的选择
2019/10/26
一、液相色谱固定相
stationary phases of LC
1. 液-液分配及离子对色谱法固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
2019/10/26
第三章 高效液相色谱
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-1 概述
பைடு நூலகம்
一、高效液相色谱法特点
Characteristic of HPLC 二、影响色谱峰扩展及分离的因素
The factors that influence peak expansion and sepration
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/10/26
2019/10/26
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因 子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/10/26
定性分析用高效液相色谱法确定未知样中的成分课件
液相色谱仪工作原理图
三． 仪器和试剂：
1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2． 色谱柱：C18 3． 超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4． 注射器：50微升
5． 流动相： 80%甲醇+20%的水，制备 前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5， 进入系统色谱前，用超声波发生器或水 泵脱气。
3、哪些条件会影响浓度测定值的准确性？
4.、为什么流动相和样品要进行脱气，否 则会产生什么影响？
注意:
关机前，用过缓冲盐溶液必须先用100% 的水冲洗系统（打开排液阀，调流速为 5ml/min，冲洗约5 min，然后调流速为 1ml/min，待流速降下来后，关闭排液阀， 再冲洗冲洗约20 min）；
在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决 于它们在固定相和流动相中的分配系数K：
K=（组分在固定相中的浓度）/（组分在流
动相中的浓度）
显然，K值越大，组分在固定相上的停留时间 越长，容易理解：溶质流经色谱柱时，K值越大停 留的时间也越长，K值越小，停留的时间也越短， 当组分在固定相的K不同，就会出现差速迁移，从 而达到分离的目的。
一． 实验目的：
1． 学习高效液相色谱仪的基本操作方法；
2． 学习用高效液相色谱法确定未知样中的 组分，掌握采用高效液相色谱法对物质进行定性分析。
二． 实验原理：
液相色谱法就是同一时刻进入色谱柱中的各组分， 由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子 交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在 两相间进行反复多次（103～106次）地分配过程，使 得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留 能力明显差异的效果，进而各组分在色谱柱中的移动 速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开 来：
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
Βιβλιοθήκη 高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)
分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；
最新文档-高效液相色谱定性定量分析方法-PPT精品文档
为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
高效液相色谱定性定量分析方法
申海艳 2019-11-10
诚信
奉献
改善
利他
为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
• 面积归一化法 • 标准曲线法 • 内标法 • 标准加入法
按测量参数分为峰面积法和峰高法
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利他
为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
定量分析
色谱定量分析，峰高法和峰面积法的选择主要取 决于检测器线性范围内，峰高和峰面积的准确性和重 现性。
归一化法最好选择峰面积法。 标准曲线法、内标法和标准加入法可选择峰高法或 峰面积法定量。
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
• Ci=fiAi • Ci=fiHi
• 实际修饰公式为：y=ax+b
诚信
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为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
定量分析方法
(Xi X)2(Yi Y)2
• 其中，X及Y分别代表不同方法的实验值及平
均值
诚信
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利他
为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
准确度的影响因素
• 标样的可靠性及其配制的准确度 • 色谱方法的可靠性 • 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） • 进样器的准确度，进样技术
高效液相色谱定性定量分析方法
申海艳 2019-11-10
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色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
• 面积归一化法 • 标准曲线法 • 内标法 • 标准加入法
按测量参数分为峰面积法和峰高法
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定量分析
色谱定量分析，峰高法和峰面积法的选择主要取 决于检测器线性范围内，峰高和峰面积的准确性和重 现性。
归一化法最好选择峰面积法。 标准曲线法、内标法和标准加入法可选择峰高法或 峰面积法定量。
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
• Ci=fiAi • Ci=fiHi
• 实际修饰公式为：y=ax+b
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定量分析方法
(Xi X)2(Yi Y)2
• 其中，X及Y分别代表不同方法的实验值及平
均值
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为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
准确度的影响因素
• 标样的可靠性及其配制的准确度 • 色谱方法的可靠性 • 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） • 进样器的准确度，进样技术
高效液相色谱定性定量分析方法
2
1
134.2
220.2
0 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)
由分子量及其 质谱图可以确 定该代谢物为 乙酰化氨脒
定性分析—两谱联用定性
定性分析—其他方法
1 收集洗脱物后进行定性分析
` 收集色谱分离后的每一个分离组分 ` 对所得组分分别进行仪器、化学分析或其他物理
参数（如熔点、沸点、折光、旋光等）测定
定性分析—其他方法
收集组分时应注意
` 某些情形，如色谱分析，宜采用非破坏性检测器，电化 学检测器不可；
` 如使用破坏性检测器，则须在检测器前分流，使分离后 的一小部分组分进入检测器
` 可根据文献数据和对照品选用已知标准物 ，再用已知标准物进行定性
定性分析—保留值定性
3 利用已知物增加峰高法定性
将已知标准物质加到待测样品，若某一峰 增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使 该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物 为同一物质
定性分析—保留值定性
4 用三维图谱检测器定性
` 如果HPLC仪配备有三维图谱检测器，除比较未 知组分与已知标准物保留时间外，还可比较两 峰的立体构形
条件下应该有相同的保留值； 但相反结论却不成立，即相同色谱条件下
，具有相同保留值的两个物质不一定是同一 个物质。尚需一些辅助技术 ` 利用两谱联用定性；
其他方法定性
定性分析—保留值定性
1 已知物保留值直接对照法定性
` 未知峰保留值(t’R或V’R)与某标准物完全 相同，可初步确定为同一物质
` 改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍 完全相同，则可认定为同一物质
1
134.2
220.2
0 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)
由分子量及其 质谱图可以确 定该代谢物为 乙酰化氨脒
定性分析—两谱联用定性
定性分析—其他方法
1 收集洗脱物后进行定性分析
` 收集色谱分离后的每一个分离组分 ` 对所得组分分别进行仪器、化学分析或其他物理
参数（如熔点、沸点、折光、旋光等）测定
定性分析—其他方法
收集组分时应注意
` 某些情形，如色谱分析，宜采用非破坏性检测器，电化 学检测器不可；
` 如使用破坏性检测器，则须在检测器前分流，使分离后 的一小部分组分进入检测器
` 可根据文献数据和对照品选用已知标准物 ，再用已知标准物进行定性
定性分析—保留值定性
3 利用已知物增加峰高法定性
将已知标准物质加到待测样品，若某一峰 增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使 该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物 为同一物质
定性分析—保留值定性
4 用三维图谱检测器定性
` 如果HPLC仪配备有三维图谱检测器，除比较未 知组分与已知标准物保留时间外，还可比较两 峰的立体构形
条件下应该有相同的保留值； 但相反结论却不成立，即相同色谱条件下
，具有相同保留值的两个物质不一定是同一 个物质。尚需一些辅助技术 ` 利用两谱联用定性；
其他方法定性
定性分析—保留值定性
1 已知物保留值直接对照法定性
` 未知峰保留值(t’R或V’R)与某标准物完全 相同，可初步确定为同一物质
` 改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍 完全相同，则可认定为同一物质
第十章高效液相色谱法-精选文档97页
用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了 气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而 成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出 物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分 离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高 效或现代液相色谱法。
2019/11/12
C. 梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的 溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强 度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果， 缩短分析时间的目的。
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整 混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色 谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升 温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的 极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度 程序）来达到。
灵敏度低、对温度 敏感、不能用于梯度洗 脱；
偏转式、反射式和 干涉型三种；
2019/11/12
d. 荧光检测器
（fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
2019/11/12
第三节 液-固色谱法
2019/11/12
一、HPLC与经典LC区别
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2019/11/12
C. 梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的 溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强 度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果， 缩短分析时间的目的。
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整 混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色 谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升 温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的 极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度 程序）来达到。
灵敏度低、对温度 敏感、不能用于梯度洗 脱；
偏转式、反射式和 干涉型三种；
2019/11/12
d. 荧光检测器
（fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
2019/11/12
第三节 液-固色谱法
2019/11/12
一、HPLC与经典LC区别
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
高效液相色谱定性定量分析方法==
N
吸光度（ Absorbance UV/Vis）检测 • 目前实验室中最流行的选择 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA） • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
吸光度检测器（ UV/Vis）－ 优点 • 这种检测器简单、可靠 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的
泵的保养： • • • • • 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污 染；
柱的保养： • • • • • • • • • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
• 试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
吸光度（ Absorbance UV/Vis）检测 • 目前实验室中最流行的选择 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA） • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
吸光度检测器（ UV/Vis）－ 优点 • 这种检测器简单、可靠 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的
泵的保养： • • • • • 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污 染；
柱的保养： • • • • • • • • • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
• 试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
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