ELISA,Western Blot,免疫组化的区别
免疫学实验方法
免疫学实验方法免疫学实验方法是免疫学研究的重要部分，它通过一系列的技术手段来识别、分析免疫系统中的各种生物分子、细胞和组织，以及它们之间的相互作用。
这些方法在免疫学领域广泛应用于疾病诊断、药物研发、疫苗研究等方面，对促进免疫学的发展和应用发挥了重要作用。
下面将介绍一些常用的免疫学实验方法。
一、ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测抗体或抗原的免疫学实验方法。
该方法通过将待测抗体或抗原与固相物质结合，再加入酶标记的二抗来进行标记，最后通过酶底物的底物变色反应或荧光底物的发光反应来检测待测抗体或抗原的存在量。
二、流式细胞仪流式细胞仪是一种用于分析和计数悬浮细胞的仪器，它利用激光照射细胞，通过细胞膜上的特异性抗体标记来检测细胞的表面标记物和内部细胞器的性质和分布，对免疫细胞的表型和功能进行高效的分析。
三、免疫印迹法免疫印迹法是一种用于检测蛋白质的免疫学实验方法，通过电泳将待测蛋白分离，再将其转移到膜上，最后使用特异性抗体和标记的二抗来检测待测蛋白的存在量和大小。
四、免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织中特定蛋白的免疫学实验方法，通过将组织切片后进行脱水、脱脂和脱水处理，再使用特异性的抗体来标记待测蛋白，并观察标记物的颜色变化或发光情况来确定蛋白的位置和表达量。
五、免疫沉淀法免疫沉淀法是一种用于检测蛋白相互作用的免疫学实验方法，通过将待测抗体与蛋白结合，再使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将蛋白抗原免疫沉淀下来，最后使用核酸酶或质谱技术来分析蛋白的互作关系。
以上介绍的是一些常用的免疫学实验方法，它们在免疫学研究中起着举足轻重的作用，不仅在科研领域有重要应用，同时在临床诊断和治疗中也有着广泛的运用。
希望以上内容能够对您有所帮助。
PCR、Western blot、免疫组化(实验原理)
PCR实验原理：聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
相比于细胞内复杂的DNA复制，PCR的反应体系相对较简单。
其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
反应体系包括cDNA模板、引物、dNTP、PCR缓冲液、Taq聚合酶等。
PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性—退火—延伸这三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
临床免疫学检验方法与应用
临床免疫学检验方法与应用免疫学是一门研究机体对抗病原体、维持免疫平衡的科学，其在临床诊断中起着举足轻重的作用。
免疫学检验方法多种多样，能够准确地检测机体的免疫状态，有助于诊断和治疗各种疾病。
本文将介绍几种常见的临床免疫学检验方法及其应用。
1. ELISA法ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的免疫学检验方法，通过酶标法测定抗体或抗原的存在量。
ELISA法可用于检测HIV、乙肝、梅毒等疾病的抗体水平，也可用于测定药物浓度或病毒载量。
由于ELISA法操作简便、灵敏度高，因此在临床诊断中得到广泛应用。
2. 免疫荧光法免疫荧光法是一种通过检测抗体或抗原在细胞或组织中的荧光信号来进行免疫检测的方法。
免疫荧光法被广泛用于自身免疫性疾病的诊断，如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。
通过观察免疫荧光信号的强度和分布，可以判断患者的免疫状态和疾病程度。
3. 免疫印迹法免疫印迹法（Western Blot）是一种通过检测抗体与特定抗原结合而形成的免疫复合物来进行检测的方法。
免疫印迹法主要用于检测蛋白质的表达水平和鉴别不同蛋白质。
在临床上，免疫印迹法常用于肿瘤标记物的检测和分析，有助于早期发现恶性肿瘤。
4. 细胞免疫学方法细胞免疫学是研究机体免疫细胞及其功能的学科，其方法主要包括细胞毒活性测定、淋巴细胞亚群分析、细胞因子测定等。
这些方法在免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应的诊断和治疗中起着关键作用。
5. 其他免疫学检验方法除了上述几种常见的免疫学检验方法外，还有许多其他方法，如流式细胞仪、PCR法、化学发光法等。
这些方法在特定疾病的诊断和治疗中有其独特的应用价值，为临床医生提供了更多的诊断手段和治疗选择。
总结免疫学检验方法在临床诊断中发挥着不可替代的作用，能够帮助医生准确判断患者的免疫状态和疾病情况，指导治疗方案的制定和调整。
不断发展的免疫学技术为医学进步提供了强大的支持，相信随着科学技术的不断创新和进步，免疫学检验方法将在临床应用中发挥越来越重要的作用。
几种常用的抗体检测方法
几种常用的抗体检测方法常用的抗体检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法、免疫组化法、免疫印迹法（Western blotting）、流式细胞术等。
下面将对这些方法进行详细介绍。
1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种常用的抗体检测方法。
它利用酶标记二抗与被测物中特异性抗体结合，通过酶的底物反应来检测被测抗体的存在。
ELISA有直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等多种变种。
这些变种根据目标抗体、需求灵敏度、特异性等因素选择适当的方法。
2.免疫荧光法：免疫荧光法利用荧光染料标记的抗体与特定抗原结合，利用荧光显微镜观察样本中的荧光信号。
它分为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。
直接免疫荧光法直接将荧光素标记于抗体上，观察样本中的荧光信号。
间接免疫荧光法则是先用一抗结合目标抗原，再用荧光素标记的二抗来检测一抗的位置。
3.免疫组化法：免疫组化法是一种用于检测细胞或组织样本中特定抗原的方法。
它利用抗原与抗体的特异性结合来检测目标蛋白的分布。
在免疫组化中，一般使用免疫荧光或酶标记的二抗来观察抗原的位置。
通过对显微镜观察或图像分析，可以得出目标蛋白的表达情况。
4. 免疫印迹法（Western blotting）：免疫印迹法是一种用于检测特定蛋白质的方法。
通过将细胞或组织溶解后的蛋白质样品进行SDS-电泳分离，然后将分离的蛋白转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白结合，再用酶标记的二抗或放射性同位素进行信号检测。
通过观察带有目标蛋白的免疫印迹图谱，可以确定特定蛋白的存在及其表达量。
5.流式细胞术：流式细胞术是一种可以通过检测细胞表面或细胞内特定抗原的方法。
它结合了免疫磁珠的标记和激光生物学。
通过将样本中的细胞和抗体共孵育，利用流式细胞仪来检测细胞检测物的存在以及细胞表型特征。
流式细胞术可以用于单细胞检测、免疫细胞表型分析、测定细胞凋亡等方面。
总结起来，常用的抗体检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法、免疫组化法、免疫印迹法（Western blotting）、流式细胞术等。
免疫学检验的方法和特点
免疫学检验的方法和特点免疫学检验是一种通过检测和分析机体免疫系统相关指标来评估机体免疫功能的方法。
它可以用于疾病的诊断、预防和治疗过程中，对于研究免疫系统的功能和疾病的免疫机制也具有重要意义。
免疫学检验的方法主要包括体外诊断试验、免疫组化技术和流式细胞术等。
下面将逐一介绍这些方法的特点和应用。
1. 体外诊断试验：体外诊断试验是最常用的免疫学检验方法之一，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫印迹（Western Blot）等。
这些试验通过检测血清中的抗体或抗原来评估机体的免疫状态。
其特点是操作简单、结果准确可靠、样本来源广泛，可以用于检测多种疾病，如感染病、自身免疫病等。
体外诊断试验的优势在于可以进行大规模筛查，对于人群健康状况的监测和疾病的早期诊断具有重要意义。
2. 免疫组化技术：免疫组化技术是利用抗体与组织或细胞中特定分子的结合反应来检测和定位这些分子的方法。
常用的免疫组化技术包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色（IF）等。
这些技术可以用于检测和定位肿瘤标志物、炎症细胞因子、免疫细胞表面标志物等，对于疾病的诊断和治疗有重要的指导意义。
免疫组化技术的优势在于可以直接观察到分子的表达和分布情况，具有较高的灵敏度和特异性。
3. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过检测和分析细胞表面标志物来鉴定和分类细胞的方法。
通过标记细胞表面的抗原或抗体，结合流式细胞仪的高速流式分析技术，可以对单个细胞进行高通量的检测和分析。
流式细胞术可以用于检测和鉴定免疫细胞亚群、肿瘤细胞、干细胞等，对于疾病的诊断和治疗选择有重要的指导作用。
流式细胞术的优势在于可以同时检测多个指标，对于复杂的样本分析有较高的效率和准确性。
免疫学检验的特点包括以下几个方面：1. 高度特异性：免疫学检验方法可以通过特异的抗体-抗原反应来检测和定量分析特定的分子或细胞，具有较高的特异性。
这使得免疫学检验方法在疾病的诊断和治疗中具有重要的优势，可以准确地鉴定和区分不同的疾病类型。
现代医学中的免疫学鉴定技术
现代医学中的免疫学鉴定技术随着科技的不断发展，现代医学已经发展到了一个新的高度。
免疫学作为现代医学中一个重要的领域，对于诊断、治疗和预防疾病都有着重要的作用。
在现代医学中，有很多免疫学鉴定技术被广泛应用。
本文将分别介绍其中的几种技术。
1. 酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA是一种非常常见的免疫学鉴定技术。
ELISA可以用于测定样本中某种特定的蛋白质或抗体，从而对疾病进行诊断。
该技术通常是通过酶标记的抗体来实现的。
它具有敏感度高、特异性好等优点，已被广泛应用于癌症、艾滋病、结核病等疾病的检测。
2. 免疫印迹（Western Blotting）Western Blotting是一种用于验证抗体特异性的技术，通常是用于分析血清中的抗体反应。
该技术的基本原理是将分离出的蛋白质进行电泳分离，再将其转移到膜上，并进行固定和印迹处理。
最后，用与特定蛋白质结合的抗体标记来检测目标蛋白质是否存在。
该技术在艾滋病、乳腺癌等疾病的鉴定中被广泛使用。
3. 免疫荧光技术（IFA）IFA是一种通过荧光显微镜来检测抗体或抗原的技术。
具体来说，IFA应用特定的抗体标记对待检测的细胞或病原体进行染色，并通过荧光显微镜来观察目标蛋白质是否存在。
IFA通常用于季节性感冒、风疹等疾病的诊断中。
4. 免疫电泳免疫电泳是一种通过电泳将具有不同电荷的蛋白质分离开，并通过抗体与特定的蛋白进行反应，从而诊断某种疾病的技术。
免疫电泳通常用于血液蛋白质异常的检测、肾病的诊断等。
5. 免疫荧光细胞排序（FACS）免疫荧光细胞排序是一种通过荧光激发分选单个细胞或微粒的技术。
FACS可以通过多种荧光标记来分别测定特定蛋白质的表达、淋巴细胞分类、溶酶体活性等。
该技术在肿瘤研究、免疫细胞研究等领域被广泛应用。
综上所述，现代医学中的免疫学鉴定技术具有广泛的应用，可以用于人类疾病的预防、治疗和诊断。
虽然每种技术有着自身的优缺点，但是这些技术的发展和应用，将在未来几年中对人类的健康产生更为深远的影响。
免疫组化技术
组织学切片制作
石蜡切片：观察组织细胞结构的理想方法
较好的保持组织细胞的形态结构 切片有连续性 长期存档，供回顾性研究 由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交
探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到 的颜色/形态都较冰冻切片好。 抗原的保存量不如冰冻切片。
抗原修复
化学方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶
优点：此方法由于微波场内极性分子、离子高速 运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复 正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对 抗原再现效果好。
抗原修复
高压加热法暴露抗原 ：将玻片浸入抗原修复液 内，置高压锅中高压 2～3min，可取得极好的效 果。
优点：由于高压下受热均匀，特别适用于大批量 标本的染色。 应用于一些较难修复的抗原。
量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中
生物素——抗生物素染色法最常用（ABC法）。
常用的染色方法
免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。
• 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞 或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗 原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发 出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的 定位，进而还可进行定量分析。
加热方法 水浴加热法 微波照射法 高压加热法
抗原修复
化学方法 :主要是通过一些酶的作用，使抗原决 定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
•胰蛋白酶：主要用于细胞内抗原的显示；-：一 般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37 度 10～40min， •胃蛋白酶：主要用于细胞间质抗原的显示。一般 使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37 度30～ 180min， 例如：Laminin、CollagenIV
ELISA,Western Blot,免疫组化的区别
页眉内容免疫组化是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。
样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。
elisa（酶联免疫吸附试验）用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。
免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。
Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。
western bolt先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。
免疫学三大工具，免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
以下western和Elisa的区别不是原创，是找的资料。
western blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较烦elisa可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。
WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响WB所检测的一般是抗原，而Elisa抗原抗体都可以检测。
WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而Elisa无能为力，一锅端了。
WB所适用的一抗一般是线性位点的，ELISA线性或构象型抗体都可以使用。
wb和elisa原理
wb和elisa原理
WB和ELISA是两种常用的蛋白质检测技术。
WB即WesternBlotting，是一种检测蛋白质的方法，通常用于确定特定蛋白质在复杂混合物中的存在和定量。
ELISA即Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，是一种通过酶标记的抗体来检测特定蛋白质的方法，通常用于测定血清或其他生物样本中的蛋白质含量。
WB的基本原理是利用电泳将复杂混合物中的蛋白质分离出来，然后将其转移到固定在膜上的蛋白质。
接下来，使用一种特定的抗体来探测目标蛋白，通常是标记有荧光素或放射性同位素的抗体。
这种方法可以检测蛋白质的存在、大小和量。
ELISA的基本原理是将待检测的蛋白质用一层特定的抗体捕获在微孔板上，然后使用另一种标记有酶的抗体来探测目标蛋白质。
酶标记抗体与目标蛋白质结合后，添加底物后酶会催化反应产生颜色或荧光，从而测定蛋白质的含量。
总之，WB和ELISA都是常用的蛋白质检测技术，但其原理和应用略有不同。
需要根据实验需要选择合适的方法。
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免疫印迹法和ELISA检测过敏原结果比较
免疫印迹法和ELISA检测过敏原结果比较引言过敏是一种常见的免疫反应，它可能导致症状包括呼吸困难、皮疹、肠胃不适等。
过敏源可以是多种物质，包括花粉、某些食物、家居灰尘等。
为了确定过敏源并制定合适的治疗方案，需要进行过敏原检测。
目前，传统的免疫印迹法和ELISA检测法是常用的过敏原检测方法。
本文将对这两种方法进行比较，以帮助评估选择最合适的过敏原检测方法。
免疫印迹法1.定义免疫印迹法，也称为Western Blotting，是一种应用于蛋白质检测的技术。
它基于电泳分离蛋白质并转移至固体支撑表面的原理，通过特异性抗体与靶蛋白结合的方法来检测特定蛋白质。
2.操作具体操作步骤如下：•经过SDS-PAGE电泳分离的蛋白质样品被转移到硝酸纤维素或聚氨酯膜上；•用抗原特异性的一抗与蛋白质结合；•加入二抗结合于一抗上的酶发生化学反应，使被检测目的蛋白质按特定颜色成像。
3.优缺点优点：•特异性高；•可以同时检测多个蛋白质。
缺点：•操作较为繁琐；•对试样量要求高；•分离光谱和电泳前的特定色谱处理效应对结果有影响。
ELISA1.定义ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），也称为酶标记免疫吸附测定法，是一种用于检测蛋白质或其他分子的方法。
ELISA利用抗体与特异性抗原结合的原理，利用酶标记抗体与抗原结合的结果来进行分析。
2.操作具体操作步骤如下：•选择特定抗体，将其吸附到微孔板上；•加入一定量的被检样本，使其结合到抗体上；•加入酶标记抗体并使其与抗原结合；•加入显色底物，记录吸光度测量结果，根据标准曲线计算出样本中某种特定抗原的存在量。
3.优缺点优点：•高度敏感度；•操作较为简便。
缺点：•不能检测多个蛋白质；•可能出现假阴性和假阳性反应。
比较1.灵敏度和特异性对比两项检测法，ELISA检测法的灵敏度、特异性均明显高于免疫印迹法。
ELISA检测法可以检测出更少量的目标物质并消除假阳性的干扰。
测抗体的方法
测抗体的方法
1. 免疫组化法（Immunohistochemistry，IHC）：将标记有特定抗体的染色剂与组织样本中的目标抗原结合，通过显色或荧光等方式观察抗原的存在和定位。
2. 免疫荧光法（Immunofluorescence，IF）：使用荧光标记的
抗体与组织样本中的抗原结合，通过荧光显微镜观察抗原的存在和定位。
3. 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：将目标抗原与固相载体结合后，使用特异性抗体进
行检测，通过底物的酶反应生成显色或荧光信号来定量测定抗体的含量。
4. 免疫印迹法（Western Blot，WB）：通过将蛋白质样本经SDS-PAGE电泳分离后，将目标蛋白迁移到膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白结合，通过显色剂检测抗体和蛋白质的结合情况。
5. 流式细胞术（Flow Cytometry）：将荧光标记的抗体与单个
细胞或细胞悬液中的目标抗原结合，通过流式细胞术仪器检测细胞的荧光强度和分布，分析抗体的亲和力和细胞表面蛋白的表达情况。
6. 中和试验（Neutralization Assay）：用抗体与病原微生物进
行体外中和反应，观察抗体对病原微生物感染能力的抑制作用。
以上仅为常用的几种测量抗体的方法，具体的方法选择要根据研究目的和实验条件来确定。
免疫组化抗体选择
免疫组化抗体选择免疫组化是一种广泛应用于生物医学研究的技术，可以利用特异性抗体对组织或细胞中的分子进行定位和分析。
在实际操作中，选择合适的抗体是至关重要的，因为抗体选择的正确性决定了实验结果的准确性和可信度。
本文将对免疫组化抗体选择的相关内容进行介绍。
一、抗体来源在抗体选择中，首先要确定抗体的来源。
常见的抗体来源有动物、人类和单克隆抗体等。
1.动物抗体：常用的动物抗体包括兔、小鼠、大鼠、绵羊、猪等。
其中，小鼠和兔的抗体较为常用。
小鼠抗体制备相对容易，价格较便宜，但存在交叉反应和不同克隆间的差异等问题；兔抗体的特异性较高，但价格相对较高，且易产生非特异性的背景信号。
2.人类抗体：人类抗体的来源可以是人体免疫细胞库、人类B淋巴细胞杂交瘤等。
人类抗体具有高度的特异性和亲和性，且不存在动物来源抗体引起的交叉反应等问题，但价格较高。
3.单克隆抗体：单克隆抗体是指来自同一种克隆细胞的抗体。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的特异性和更好的重复性，但价格较高，且制备过程复杂。
二、抗原选择抗体的特异性是由其结合的抗原决定的，因此选择合适的抗原对于获得特异性抗体是至关重要的。
1.天然蛋白：天然蛋白是最常见的抗原形式之一。
其中，重组蛋白是一种受欢迎的选择，因为其可以通过工程技术来优化其受体结合性能。
2.肽段：肽段也是常用的抗原，其具有较低的价格和良好的重复性。
通常，选择相应的肽段以覆盖目标蛋白质中的所需区域，从而提高抗原的特异性。
3.人工合成分子：人工合成分子可以通过选择特定的化合物或糖类等，以获得与目标分子不同的抗原。
这种抗原的优点在于其纯度高、具有良好的重复性以及可控性高。
三、特异性测试在选择抗体之前，需要进行一系列的测试来确定其特异性和亲和力。
1. Western Blot: Western blot是一种常见的蛋白质检测方法，可以用于检测抗体对蛋白质的特异性，同时检测蛋白质是否纯化以及蛋白质的大小。
在选择抗体时，可以将其与不同表达蛋白质的细胞系一起进行Western blot测试，以确定其特异性。
手把手教会WB和免疫组化
一抗不识别待检物种的蛋白 （参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目
的蛋白会发生反应，设置阳性对照） ；
抗原量不足 （每条泳道蛋白上样量不低于 20-30ug， 使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照） ； 组织中目的蛋白含量低 （浓缩使信号最大化，例如检测核蛋白可用核裂解物） ； 转膜不充分（用丽春红染色检测转膜效果） ； 洗膜过度 （勿过度洗膜） ； 过度封闭使目标蛋白不能显色（使用 0.5%脱脂奶粉或无奶粉的抗体稀释液，或更换封闭
15% SDS-PAGE
水 30%丙烯酰胺 Tris (pH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸铵 TEMED 1.1 2.5 1.3 0.05 0.05 0.004 2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.008 3.4 7.5 3.8 0.15 0.15 0.012 4.6 10.0 5.0 0.2 0.2 0.016 5.7 12.5 6.3 0.25 0.25 0.02 6.9 15.0 7.5 0.3 0.3 0.024 9.2 20.0 10.0 0.4 0.4 0.032 11.5 25.0 12.5 0.5 0.5 0.04
将待检组织大块组织需剪切成小块或细胞等样品用裂解液常用ripa裂解液蛋白酶抑制剂裂解一般的样品经裂解液处理数分钟后细胞均可破裂有些样品较难裂解可用匀浆器辅助裂解所得裂解液以1000012000g的离心力离心取上清即为实验样品制备过程均需在4条件下进行样品通常于20保存若使用周期较长则保存于80
WB、免疫组化方法及配方
一、免疫印迹法（Western blot）
原理：
免 疫印 迹（ immunoblotting ） 又称 蛋白 质印 迹（ Western blotting ） ， 是根 据抗 原抗 体的 特异性 结合检 测复杂 样品中 的某种 蛋白的 方法 。该法 是在凝 胶电泳 和固相 免疫测 定技 术基础 上发展 起来的 一种免 疫生化 技术 。 由于 免疫印 迹具有 SDS-PAGE 的高 分辨 力和 固相免 疫测定 的高特 异性和 敏感性 ，现已 成为蛋 白分析 的一种 常规技 术 。免疫 印 迹常 用于鉴 定某种 蛋白， 并能对 蛋白进 行定性 和半定 量分析 。结合 化学发 光检测 ，可 以同 时比较 多个样 品中同种 蛋白的 表达量 差异。 其原 理为 ，将混 合抗原 样品在 凝胶板 上进行 单向或 双向电 泳分离 ，然后 取固定 化 基质 膜与凝 胶相贴 。在印 迹纸的 自然吸 附力 、电场 力或其 它外力 作用下 ，使凝 胶中的 单一 抗原组 份转移 到印迹 纸上 ，并且 固相化 。最后 应用免 疫覆盖 液技术 如免疫 同位素 探针 或免疫 酶探针 等，对抗 原固定 化基质 膜进行 检测和 分析 。
ELISA、western blot、免疫组化、RT-PCR实验方法原理及其在SCI论文材料方法、结果中的写作.
Western blot
实验操作
步骤二、蛋白定量
Western blot
实验操作
步骤三、SDS-PAGE
E
• SDS 是一种离子性的表面活性剂,它有强离子性的硫 酸根离子也带有疏水性的长碳链。
• 当 SDS 与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质的 疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以磺酸根离子 外露与水分子作用。大多数蛋白质和 SDS 的平均结 合量是 1:1.4 (以重量为单位)，而蛋白质结合固定比 例的SDS 后 ，由于 SDS 带强负电荷，使蛋白质原先 所带电荷显得微不足道,且每单位重量的蛋白质所带 电荷一致 ，所以不同蛋白质的迁移率大小就主要由 蛋白分子大小这一主要因素决定。
辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP） （3）酶反应的底物。
ELISA
方法种类
直接法——检测Ag
将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可 测定抗原总量。 优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。 缺点：实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做 标记，费用相对提高。
➢ 原理：
Western blot
应用
Western Blot 被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床 医学的研究。
➢ 目的蛋白的表达特性分析 ➢ 目的蛋白与其它蛋白的互作 ➢ 目的蛋白的组织定位 ➢ 目的蛋白的半定量分析
Western blot
蛋白提取
实验操作
蛋白定量
SDS-PAGE
转膜
封闭
ELISA
方法种类
间接法——检测Ab
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色。 优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分 析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。 缺点：交互反应发生的机率较高。
蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)
（4）IgM 抗体的检测
1）间接法：
间接法 ELISA 一般仅适用于检测总抗体或 IgG 抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清
中的 IgM 抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的 IgG 抗体，后者将竞争结合固相抗原而
使一部分 IgM 抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。 因此，如果用抗 IgM 作为二抗，
单克隆抗体＋单克隆抗体 后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固 相载体和制备酶结合物。 用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其 不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。 双抗体夹心法测抗原的方法： 捕获抗体包被→封闭（3％BSA）→待测抗原→洗涤（含 0.1％Tween 的 PBS)→酶标单抗或
1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上，然后与能特异性 识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特 异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入 适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带 的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 2 操作过程 SDS-PAGE 电泳→转膜（PVDF 或硝酸纤维素膜） 封闭→一抗→洗涤→酶标二抗反应 洗涤→显色或化学发光显影
Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. 3 注意的问题 （1） 蛋白质电泳 常用 SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性 PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine 胶中电泳：用于分子量小于 10kDa 的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离 效果。 （2）转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝 胶大小一致 以适量的转移 Buffer 室温平衡滤纸、凝胶和膜 15－30min，如果是 PVDF 膜，必须先用甲 醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰 染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置 （3）封闭 用 5％脱脂奶粉或 3％BSA （含 0.1％Tween20 TBS 或 PBS 配制） 时间：室温 2h 或 4ºC 过夜 （4）显色或显影 显色 辣根过氧化物酶：底物为 DAB 碱性磷酸酶：底物为 BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含 Tween20 的 TBS 或 PBS 洗涤一次曝光的时间和显影的时间根
免疫组化与Western
免疫组化与Western blot的区别个⼈感觉还是有⼀定的区别的，从难度上来说，western⽐免疫组化容易些。
western可以⽤内参，使结果更真实。
western也可以组织定位，不过⽐较粗略，如果想看具体的位置，⽐如想要了解是哪些细胞，就要⽤到免疫组化。
可以两个结合起来⽤。
免疫组化⼀般都是在组织上做，细胞上做的好像叫免疫过氧化物酶单层试验，叫法不⼀样。
具体应⽤那个要看你有什么样的实验材料了。
做Western Blot⽤组织的很少，⼲扰太多了，⼀般都是细胞培养出来的样品。
如果你想知道某蛋⽩的组织表达特异性，⽤免疫组化，即可定位如果想知道该蛋⽩在细胞中中有没有表达，⽤western，可定量⾸先得从免疫组化和western bolt之间的原理说起⾛哈，免疫组化，故名⽰意，应该是在组织上作的免疫荧光染⾊，包括冰冻切⽚和⽯蜡切⽚，⽽western作的是蛋⽩质电泳，⼀般是细胞破壁后的蛋⽩表达物免疫组化除了可以定量之外，还可以定位。
做免疫组化的标本来源可以是新鲜组织也可以是保存的蜡块，但western只能⽤新鲜组织免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（⼜称表位），有些表位是线性的，⽽有的属于构象型；线性表位不受蛋⽩变性的影响，天然蛋⽩和煮后的蛋⽩都含有；构象型表位由于受蛋⽩空间结构限制，煮后变性会消失。
如果你所⽤的抗体识别的是蛋⽩上连续的⼏个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时⽤于免疫组化和Western，⽽如果抗体识别构象形表位，则只能⽤于免疫组化。
⼀般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。
（限于单抗）因为如果⽤普通显微镜只能看出阳性阴性，但在带有图像采集摄像系统的显微镜，采集软件带有⾃动分析功能，根据所标定的⾯积内阳性组织或细胞的⾯积来⾃动算出阳性率，因其⼈为因素较多，只能说是半定量。
单克隆抗体浓度测定方法
单克隆抗体浓度测定方法单克隆抗体浓度测定单克隆抗体浓度测定是一项关键的实验技术，用于确定单克隆抗体在样本中的浓度。
本文将介绍几种常用的测定方法。
ELISA法ELISA法是最常用的单克隆抗体浓度测定方法之一。
以下是ELISA 法的步骤：1.涂覆：将抗原溶液均匀涂覆在酶标板上。
2.固定：将酶标板放置在低温环境中，使抗原固定在酶标板上。
3.阻断：加入非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）阻止非特异性结合。
4.反应：加入待测样本和单克隆抗体试剂，并孵育一段时间。
5.洗涤：用缓冲液洗涤酶标板，去除未结合的物质。
6.显色：加入底物溶液，使酶标板上的酶催化反应发生显色。
7.停止反应：加入停止剂，停止酶催化反应。
8.测定：用酶标仪测定反应溶液的吸光度，根据标准曲线计算待测样本中单克隆抗体的浓度。
Western Blot法Western Blot法也被广泛应用于单克隆抗体浓度测定。
以下是Western Blot法的步骤：1.蛋白质电泳：将待测样本和已知浓度的单克隆抗体样品进行SDS-PAGE电泳分离。
2.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到聚乙烯二醇膜（PVDF）上。
3.阻断：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）阻止非特异性结合。
4.孵育：加入标记有特异单克隆抗体的二抗，孵育一段时间。
5.洗涤：用缓冲液洗涤膜，去除未结合的物质。
6.显色：加入底物溶液，使特定蛋白质产生显色反应。
7.测定：用图像分析系统测量显色带的强度，根据已知浓度的单克隆抗体样品构建标准曲线计算待测样本中单克隆抗体的浓度。
免疫组化法免疫组化法是通过单克隆抗体与待测样本中的特定抗原结合来测定单克隆抗体浓度的方法。
以下是免疫组化法的步骤：1.取样：采集待测样本，如血液或组织切片。
2.固定：使用适当的固定剂将样本固定在载玻片上。
3.渗透：使用适当的加热或酶处理方法，增加抗体对抗原的渗透性。
4.成像：加入标记有荧光物质或酶标记的单克隆抗体试剂，与样本中的特定抗原结合。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，去除未结合的物质。
生物医学实验入门（11）：免疫组化（一）
生物医学实验入门（11）：免疫组化（一）原理童鞋们应该还记得western中提到的检测原理，蛋白-一抗-二抗三个小伙伴手拉手，如果可以用试剂检测到二抗，那么就能够间接地检测到蛋白。
其实免疫组化（包括免疫荧光，也包括ELISA）的原理与之类似，也是先用一抗识别蛋白，然后用二抗识别一抗，最后用底物与二抗上连接的酶反应并显色（免疫荧光的二抗自带荧光，所以不用与底物反应显色；有些ELISA的识别过程会稍微繁琐一点点）。
但是，与western不同的是：1.western中的蛋白通过“转膜”被结合在一张膜上，而免疫组化的蛋白是在组织上，因此免疫组化中所要检测的蛋白无需提取，只需要将组织进行简单处理即可。
免疫组化的这一特点同时也成就了它被很多人青睐的原因，就是“眼见为实”，通过免疫组化的方法可以在组织“原位”将蛋白现形，免去了组织和细胞处理、蛋白提取等诸多过程对样本外形的破坏，起到“定位”的效果；2.western中用到的蛋白样本是经过“变性”处理的，也就是我们要把从组织或细胞中提到的蛋白与loading buffer混合后“煮一煮”的（非变性电泳除外），所以western中的蛋白样本没有蛋白质高级结构，但是免疫组化中的蛋白样本是具有高级结构的，这将对一抗的选择有一定要求，详情请参见“小贴士”第1点。
操作总体上，免疫组化的操作包括7个步骤：组织固定（可选）、石蜡包埋（做石蜡切片的选择做，做冰冻切片的请跳过）、切片、蛋白复性（未固定的冰冻切片请跳过）、封闭、抗体孵育、显色。
细心的你可能发现了一个问题，做免疫组化可以有石蜡切片和冰冻切片两种选择，那究竟该怎么选择？首先我们先来解释一些基本问题：既然免疫组化是在组织上做的，那么这个组织得把它盛放到一个载体（或者你豪放地理解为容器也行）上才能操作，因为我们不能生猛地用手或者用镊子拿着组织来做免疫组化，这个载体就是一张载玻片，但不是普通载玻片，而是防脱玻片（请参见“小贴士”第2点），一般就是用多聚赖氨酸处理过的普通玻璃载玻片。
抗体检测方法
抗体检测方法抗体检测是一种常见的实验室技术，用于检测人体内特定抗体的存在和水平。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，可以识别和中和病原体，是人体抵抗疾病的重要组成部分。
在临床诊断和疾病监测中，抗体检测方法被广泛应用。
一、ELISA法。
ELISA法（酶联免疫吸附实验）是一种常用的抗体检测方法。
它利用固相酶标记的抗原或抗体与待测样品中的抗体结合，再通过酶底物的反应产生可测量的信号。
ELISA法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，广泛应用于临床诊断和生物医学研究中。
二、免疫荧光法。
免疫荧光法是一种利用荧光染料标记的抗体来检测待测样品中特定抗体的方法。
在免疫荧光显微镜下观察，可以通过荧光信号来判断抗体的存在和分布情况。
免疫荧光法具有高灵敏度、高特异性和定量性好的特点，被广泛应用于自身免疫性疾病、传染病和肿瘤等领域。
三、免疫印迹法。
免疫印迹法（Western blot）是一种检测蛋白质的方法，也可以用于检测特定抗体的存在。
通过将待测样品中的蛋白质经过电泳分离，然后转移到膜上，再与特异性抗体结合并通过化学发光或染色来检测特定抗体的存在。
免疫印迹法具有高灵敏度和高特异性，被广泛应用于蛋白质相互作用、疾病诊断和药物研发等领域。
四、流式细胞术。
流式细胞术是一种高通量的细胞分析技术，也可以用于检测细胞表面的特定抗体。
通过将待测细胞与荧光标记的抗体结合，然后通过流式细胞仪进行检测和分析。
流式细胞术具有高灵敏度、多参数分析和高通量的特点，被广泛应用于免疫学研究、临床诊断和药物筛选等领域。
五、PCR法。
PCR法（聚合酶链式反应）是一种检测DNA或RNA的方法，也可以用于检测病原体引起的抗体。
通过特异性引物和酶的作用，可以扩增和检测待测样品中的特定基因序列。
PCR法具有高灵敏度、高特异性和快速的特点，被广泛应用于传染病和遗传病的诊断、病原体检测和基因表达分析等领域。
六、蛋白质芯片技术。
蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质分析技术，也可以用于检测特定抗体。
乙酰化蛋白的鉴定
乙酰化蛋白的鉴定
1.免疫检测法：利用特异性抗体识别乙酰化的蛋白质。
Western blot和免疫组化是最常用的方法之一，具有较高的特异性和灵敏性，但需要可靠的抗体。
2.放射性检测法：利用放射性标记的乙酰基或乙酰化底物检测乙酰化反应。
虽然这种方法具有高灵敏性，但由于放射性物质的危险性和操作复杂性，应用受到限制。
3.高效液相色谱（HPLC）：通过分离和检测蛋白质水解产物中的乙酰化氨基酸，定量蛋白乙酰化水平。
这种方法需要较高的技术要求和设备支持。
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免疫组化
是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。
样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。
elisa（酶联免疫吸附试验）
用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。
免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。
Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。
western bolt
先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。
免疫学三大工具，免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
以下western和Elisa的区别不是原创，是找的资料。
western blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较烦
elisa可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。
WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到
ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响
WB所检测的一般是抗原，而Elisa抗原抗体都可以检测。
WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而Elisa无能为力，一锅端了。
WB所适用的一抗一般是线性位点的，ELISA线性或构象型抗体都可以使用。
从另一个意义上讲，WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定，而Elisa不行。
WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。
Elisa一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。
WB操作常见的非特异性条带，膜本底差，显色不好等等缺点在Elisa上表现得要好得多。
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