核糖体展示技术的原理与应用
【高中生物】核糖体知识与应用概述
【高中生物】核糖体知识与应用概述2021年10月7日，诺贝尔化学奖揭晓。
来自美国、以色列的3位科学家因“对核糖体结构和功能的研究”而获奖。
三位科学家采用X射线蛋白质晶体学技术，标识出了构成核糖体的成千上万个原子。
这不仅画出了核糖体的“外貌”，而且在原子层面上揭示了核糖体功能的机理。
至此，科学家们终于能一探核糖体的工作机制，为遗传信息的传递、蛋白质翻译等重大问题提供强有力的证据，并借此弄清一些细菌的抗药机制，研发新的抗生素，帮助人体抵抗顽固疾病。
本文中笔者对有关核糖体的知识与应用进行了归纳。
1 核糖体有关的基本知识1．1 核糖体的大小例1．下列细胞结构中，在普通光学显微镜下分辨不出的是（C）A．染色体 B．液泡 C．核糖体 D．叶绿体解析：核糖体是最小的细胞器，只有23nm左右，在光学显微镜下分辨不清。
在用差速离心技术分离细胞器时最后分离得到的细胞器是核糖体。
1．2 核糖体的化学组成例2．细胞质中含RNA最多的是（C）A．线粒体 B．细胞质基质 C．核糖体 D．叶绿体解析：核糖体的主要成分为蛋白质和RNA，二者各占一半。
rRNA可占细胞中RNA总量的80%以上。
1．3 核糖体的结构例3．下列细胞结构中，不参与细胞生物膜系统组成的是（B）A．线粒体 B．核糖体C．高尔基体 D．叶绿体解析：在核糖体中不含磷脂，也没有膜结构，不属于生物膜系统。
一个核糖体大分子通常由两部分构成：大亚基和小亚基。
大亚基是结合转运RNA的亚基，小亚基在蛋白质合成中负责信息识别。
1．4 核糖体的分布例4．叶绿体的DNA能指导自身小部分蛋白质在叶绿体内的合成。
下列叙述中错误的是（D）A．叶绿体DNA能够转录 B．叶绿体DNA是遗传物质C．叶绿体内存在核糖体 D．叶绿体功能不受细胞核调控解析：细胞中的核糖体可以游离在细胞质基质中，可以附着在粗面内质网上，在线粒体和叶绿体中也有。
不同的细胞中核糖体数量不同，在分裂旺盛的细胞和癌细胞中核糖体的数量很多。
单克隆抗体
单克隆抗体生物技术制药之单克隆抗体【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。
随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。
鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。
减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。
抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。
1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。
核糖体的分子动力学模拟及其生物合成中的应用
核糖体的分子动力学模拟及其生物合成中的应用核糖体是生物体内重要的蛋白质合成机器，它由蛋白质和RNA 分子组成，参与了生物合成中的翻译过程。
为了更好地理解核糖体的结构和功能，科学家们使用分子动力学模拟技术进行研究，这种方法可以为核糖体的生物合成应用提供更多理论和实践依据。
分子动力学模拟涉及到大量分子的运动轨迹计算和模拟，可以帮助研究人员更好地理解分子的结构和运动，为生物体内复杂的生物化学反应提供加速器和模拟工具。
在核糖体的研究中，分子动力学模拟理论可以帮助科学家们更好地理解核糖体中RNA和蛋白质结合的机制，以及如何优化核糖体的生物合成速度和效率。
核糖体的结构与生化功能息息相关。
研究人员通过分子动力学模拟技术发现，核糖体中的RNA分子起着关键的功能作用。
RNA 分子具有非常高的结构稳定性和耐受性，这种稳定性是可以被利用起来用来加速核糖体生物合成反应速度。
分子动力学模拟技术具有非常高的可视化和直观性，科学家们可以通过计算机程序模拟出核糖体分子在不同时间点舒展和收缩的状态。
这种程序模拟可以帮助研究人员更好地理解核糖体分子内体积的变化、RNA分子折叠的时间、蛋白质的合成等方面的生化过程。
通过这些分子动力学程序模拟，研究人员得以更清楚的了解到核糖体基因演化、RNA转录和翻译的分子机制，以及如何优化核糖体结构和生物合成效率。
科学家们还可以将程序模拟应用到其他生物大分子的研究中、如细胞膜蛋白结构研究、了解生物体内大分子间的相互作用等。
分子动力学模拟技术可以很好地模拟大分子结构的动态变化过程，具有很高的可视性和直观性。
科学家们可以在软件平台上建立大分子静态和动态模型，利用模拟相关参数来研究不同的生化反应速度和机制。
这种技术为科学家们提供了珍贵的计算和模拟工具。
经过多年的研究和发展，分子动力学模拟技术已经成为了生物大分子研究中的重要工具之一, 尤其是在开发新型药物、生物医学和生物制造等方面的应用被广泛探索。
核糖体的分子动力学模拟技术可以为未来的生物合成应用提供更多的理论和实践依据，使其在制药、生物技术领域得到更多优化和应用。
利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒单链抗体基因
２ 剖检 变化
尸体外观消瘦 、肝脏严重变性 、坏死 、肿大、色黄、质脆 、
防大肠 杆菌 感染 ，肌 肉注射 ２ ％痢 菌净 １ ０ ｍ ｌ 。
５ 小结与讨论
全身粘膜和皮下肌 肉可见出血点和出血斑 、胃肠粘膜有出血性炎 ５ ． １ 诊 断 症。 根据饲料分析 、剖检变化、实验室诊断，我们认为此猪场发 生二元育肥仔猪死亡病情是 由于饲喂了发霉变质麦麸引起 的黄曲 ３ 实验室诊断
中国畜牧兽医文摘
２ ０ １ ３ 年
２ ９ 卷
第ｌ 期
临 床 兽 医
仔 猪 黄 曲霉毒 素 中毒 的病 例报 告
何 维 坚
（ 广东省大埔县银江镇畜牧兽 医站 ，大埔 ５ １ ４ ２ ６ １ ）
２ ０ １ １ 年６ 月 ，梅州 市 属某 养猪 场 二元 育肥 仔 猪发 生病 情 ，１ ０ ｄ ３ ． ２ 病 料 涂 片 取病变肝组织接种于氯化钠琼脂培养基上，置３ ０ ℃培养２ ｄ 内死 亡 ｌ ５ 头 。兽 医站 相关 人 员 通过 现 场调 查 、病 理 解 剖 、实 验 室 检查确诊为黄曲霉毒素中毒 ，经及时治疗控制了病情 ，现将病情 后 ，长出白色或黄色绒毛状霉素 ，镜检与饲料 中霉素一致。 报 告如 下 。
霉 素 中毒病 。 ３ ． １ 饲料取样培 养 从 饲 喂 麦麸 各 部 随 机 取样 １ ０ 份 ，每份 约 １ ０ ｇ ，放 于无 菌 平 皿 ５ ． ２ 临床注意事项 中 ，用 ７ ５ ％酒 精处 理 １ — ２ ｍ ｉ ｎ ￣ Ｉ 无 菌蒸 馏水 荡洗 后 ，取 饲料 或浸 液 仔猪黄曲霉素中毒容易误诊为大肠杆菌病故诊断时不可忽视 分 点 接种 于 ７ ． ５ ％氯 化钠 琼 脂 培养 基上 ，每块 平 板 接种 ７ —８ Ａ 。 置 对 饲料 的分 析 。 ３ Ｏ ℃培 养４ ８ ｈ 后 ，１ Ｏ 块 平 板共 ６ ５ 个 接种 点 上 有霉 菌 生 长 。菌 落 为 ５ ． ３ 对 症 治 疗 增强肝脏的解毒能力，改善血液循环 ， 长 菌落 颜 色逐 渐 变 黄 。取培 养 物 深
核糖体展示技术PPT演示文稿
生物工程1001班 郭倩倩
1
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
核糖体展示技术
(Ribosome Display Technology, RDT)
是由Plückthun 实验室在多聚核糖体展示技术的基 础上改进而来的一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选 的新技术，它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核 糖体上， 形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白 的功筛选到一些 与靶分子特异结合的高亲和力蛋白质， 包括抗体、 多 肽、 酶等， 是蛋白质筛选的重要工具。
10
3.亲和筛选 体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终止反
应。反应试剂中始终保持5 mmol/L Mg2+浓度，稳定 mRNA-核糖体-蛋白质三元复合体。可以直接用于筛选实 验，也可以于4℃保存，核糖体复合物在4℃至少可以稳 定10 d，但产量会逐渐减少。体外筛选时加入1%-2%脱脂 奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗体的非特异性反应,肝 素还能抑制核酸酶。
CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等 。
4
产生
Kawasaki 曾建议采用类似的途径从肽库中 筛选多肽配体。在此之前，利用前期多肽抗体 进行免疫沉淀，已经分离到了与核糖体和多肽 偶联的mRNA。Mattheakis等人首次将前人的设 想付诸实践，建立了筛选多肽类配体的多聚核 糖体展示技术，并从一个库容为10^12的肽库中 ，筛选到亲和力常数达到10^9 (nmol级) 的固 定化单抗的多肽配体。Gersuk等人利用该技术 也筛选到前列腺癌肿瘤标记的多肽配体。体外 翻译时，蛋白或多肽的折叠与翻译同步进行。 与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。
2
原理
核糖体展示技术茎-环结 构， 将其转录成 mRNA，在无细胞翻译系统中进行翻译 ， 使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成 “mRNA-核糖体-选， 以乙二胺四乙酸（EDTA）解离结合的核糖体复合物或以 特异抗原洗脱整个复合物，并从中分离mRNA。通过反转 录聚合酶链反应（RT- PCR） 提供下一轮展示的模板， 所得 DNA进入下一轮富集，部分 DNA可通过克隆进行测 序分析等。
蛋白质定向进化的高通量筛选方法
山东农业大学学报(自然科学版),2008,39(4):653-656Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science ) 蛋白质定向进化的高通量筛选方法黄春晓,段学军(中原工学院能源与环境学院,河南郑州 451191)摘要:定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。
创建突变库的方法已经有很多而且比较通用,而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。
本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法,介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用,分析了存在的问题及发展趋势。
关键词:定向进化;高通量筛选方法;展示技术;流式细胞分选技术中图分类号:Q 93 文献标识码:A 文章编号:1000-2324(2008)04-0653-04收稿日期:2006-07-27基金项目:河南省教育厅自然科学基金作者简介:黃春晓(1968-),女,汉族,河南叶县人,副教授,硕士,主要从事环境生物技术的研究。
HI GH -THR OUGHPUT SCREENI NG M ETH ODS I N THE D I RECTE D EV OLUTI O N OF PR OTEI NSHUANG Chun -xiao,DUAN Xue -jun(College of Energy &Envir onment of Zhongyuan University of Technol ogy ,Zhengzhou 450007,China )Abstract:D irected evoluti on is a ne w po werful strategy f or engineering p r oteins .Many feasible methods f or gen 2erating gene libraries are devel oped .Therefore devel op ing the high -thr oughput screening methods f or desired mutants is the key t o the success in directed evoluti on .I n this article,we summarize the high -thr oughput screening methods devel oped resent years such as F ACS (Fluorescence -activated cell s orting )and the dis p lay technol ogy including phage dis p lay,cell -surface dis p lay,ribos o me dis p lay and mRNA -pep tide fusi on .Their p rinci p les and app licati on in screening for desired mutants fr om mutant libraries are intr oduced .W ediscuss the unres olved questi ons and p r om ising p r os pect in the screening methods .Key words:D irected evoluti on;high -thr oughput screening;method;dis p lay technol ogy;F ACS 定向进化技术可以将自然界漫长的蛋白质改造过程缩短到数年、数月、甚至数天。
核糖体测序方法-概述说明以及解释
核糖体测序方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述核糖体是细胞内重要的蛋白质合成机器，其结构和功能对细胞的正常运作至关重要。
核糖体测序方法是一种十分重要的技术手段，可以帮助科研人员对核糖体进行深入研究，探索其中的奥秘。
本文将介绍核糖体测序方法的原理、技术细节以及在科学研究和生物医药领域的应用前景。
通过本文的阐述，读者将能够更深入地了解核糖体测序方法的意义和重要性。
1.2 文章结构文章结构部分的内容：本文主要分为引言、正文和结论三部分。
在引言部分，将概述核糖体测序方法的重要性和应用领域，并指出文章的目的和结构。
在正文部分，将介绍核糖体的重要性、核糖体测序方法和其应用领域的详细内容。
在结论部分，将总结核糖体测序方法的优势，展望未来发展方向，并给出结论。
1.3 目的:本文旨在介绍核糖体测序方法及其在生物科学领域中的重要性和应用。
通过深入探讨核糖体的作用机制和结构特点，我们希望读者能够更加全面地了解核糖体在细胞生物学中的关键作用。
同时，我们将详细介绍核糖体测序方法的原理和技术流程，以及其在基因组学研究、药物开发和生物工程等领域的广泛应用。
通过本文的阐述，我们希望读者能够深入了解核糖体测序方法的优势和未来发展趋势，为相关领域的研究工作提供参考和借鉴。
2.正文2.1 核糖体的重要性核糖体是细胞中的一个重要细胞器，它是蛋白质合成的关键场所。
核糖体内含有大量的蛋白质和核糖核酸(RNA)，其中主要由核糖核酸构成。
核糖体通过将mRNA上携带的密码子与tRNA上携带的氨基酸配对，实现蛋白质的合成。
在这个过程中，核糖体起着至关重要的作用。
核糖体的重要性不仅体现在蛋白质合成中，还在维持细胞的正常功能和生存过程中起着重要作用。
细胞的生长、分裂、代谢等活动都离不开核糖体的参与。
在细胞的身体过程中，核糖体可根据细胞的需要不断合成不同种类和数量的蛋白质，以维持细胞正常的生命活动。
因此，核糖体的重要性在细胞生物学领域被广泛认可。
单克隆抗体基础知识
1 .在肿瘤治疗方面的应用: 单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不
良反应。如2005年我国开发出癌症治疗药——重组人 源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体(商品名：泰欣生)。泰欣生
联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的患者提高
30%以上。
2 .在器官移植中的应用: 近年来 ,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐
人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段
（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力
，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。
全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用 。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV 转化 B 淋巴细胞技术、噬 菌体显示技术（phage display）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenic mouse）和单个B
——进行SDR移植改良
嵌合抗体
人源化抗体
3.SDR移植抗体(SDR grafted antibody)
在CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密 切相关的SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上，进一 步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗 体潜在的免疫原性降至最低。
4.全人单克隆抗体（Fully humaneantibody)
药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。 不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆 抗体药物中使用。 第二代：人鼠嵌合性单抗
核糖体的结构和功能
核糖体的结构和功能核糖体是细胞负责蛋白质合成的重要分子机器，在这个过程中，它起到了至关重要的作用。
本文将介绍核糖体的结构和功能，解释核糖体的作用原理。
一、核糖体的结构核糖体是由核糖核酸、核糖蛋白和其他蛋白质组成的复合物，它们配合着完成蛋白质的合成。
核糖体的组成包括大剂量细胞组分，约占细胞整体重量的40％～50％，它的直径为15至20纳米。
核糖体主要由两个亚单位组成，一个是大的亚单位和一个小的亚单位，它们协作完成蛋白质的合成。
在人类体内，大型亚单位由约50种蛋白质和三个不同的rRNA成分组成，而小型亚单位则由约30种蛋白质和一个rRNA成分组成。
二、核糖体的功能核糖体在生命过程中具有多种功能。
它的主要功能是蛋白质合成，在这个过程中，核糖体通过识别和翻译mRNA中的基因序列，将其翻译成相应的氨基酸序列，组成蛋白质。
具体地，核糖体的功能可以勾画为以下的步骤：1. RNA转运：在核糖体开始转录mRNA之前，mRNA必须先进入细胞质，并被tRNA（转运RNA）伴侣所携带。
由于tRNA 中含有一个特定的氨基酸，因此该分子的翻译是由氨基酸的可用性和核糖体的位置决定的。
2. 初始结合：大型核糖体亚单位将mRNA和tRNA中的氨基酸一起招募进去。
核糖体的结构使得它为特定mRNA序列提供高亲和力，因此在这个过程中出现错误是非常少的。
3. 翻译：随着新的tRNA分子加入，核糖体不断扩大，以将氨基酸序列拼接起来。
在在这个步骤中，核糖体小亚单位起到了重要的作用。
它扫描mRNA上的密码子，以推进氨基酸的合成。
在这个过程中，每个相应的氨基酸序列都必须与对应的mRNA序列相配。
这就是蛋白质合成的关键所在，它决定了蛋白质的三维结构。
如果核糖体由于某种原因无法完成上述步骤，就会导致蛋白质合成的错误，并可能导致细胞功能受损。
三、结论综上所述，核糖体是一个极其重要的细胞分子机器，对人体正常运转发挥了非常重要的作用。
然而，在人的生命嵌合的过程中，由于糖体的功能所受到环境、基因和其他因素的影响，因此可能会导致内部调节出现问题。
细胞生物学综述——核糖体
核糖体功能结构探究及展望摘要：核糖体是一个核酶，用体外筛选技术发现的核酶像核糖体一样也能催化肽键形成。
RNA在生命起源中也有着不可替代的作用。
随着RNA多功能的发现，RNA被更多的人认为是生命体的生物大分子，在科学研究如新药研发中也受到了更多的关注与应用。
关键字：RNA 核酶蛋白质合成是细胞代谢最复杂也是最核心的过程, 其中涉及到200多种生物大分子参与作用。
蛋白质加工厂---核糖体(Ribosome)是一个由核糖体RNA(rRNA)和核糖体蛋白组成的复合体. 蛋白质含量约占三分之一, 而rRNA的含量占三分之二。
在蛋白质生物合中,rRNA 与蛋白质两者究竟谁起主导作用, 一直是人们感兴趣的问题, 并提出不少假说。
关于rRNA功能的假说主要有三种: 1.rRNA主要作为核糖体蛋白质装配的结构骨架, 在蛋白质合成中, 核糖体蛋白质起催化作用;2. rRNA是一种决定蛋白质序列的物质;3.rRNA具有催化活性, 它直接催化蛋白质的合成.1982年Cech通过研究原生动物四膜虫证明RNA 具有催化功能, 并称之为核酶( ribozyme)。
自此以后, 自然界中的RNA 催化功能不断被发现, T. Cech和S. A ltman也因为核酶的发现而荣获1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现具有重要的意义, 它使人们认识到, RNA的生物功能远非/传递遗传信息0那么简单, 人们开始重新审视RNA的生物学功能。
直到最近, 通过X射线衍射分析核糖体大、小亚基的结晶, 才证实了肽键的形成是由r RNA催化, 核糖体就是一种核酶, 已经可以得出结论, 在核糖体内蛋白质主要起维持rRNA 的构象, 起辅助作用; 在蛋白质合成过程中rRNA起到非常重要的作用。
肽酰转移酶中心核糖体大亚基的精细结构表明, 核糖体大亚基空腔的底部, 是P位点上肽酰tRNA 与A位点上氨酰tRNA 相互作用形成肽键的部位, 称为肽酰转移酶中心。
在肽键形成处2nm的范围中,完全没有蛋白质的电子云存在,肽酰转移酶中心完全由23SrRNA的结构域组成，而蛋白质主要起维持rRNA的构象,起辅助作用。
全人源抗体
第五章 人源性抗体第二节 全人源抗体单抗的人源化，其主要目的就是通过各种手段降低鼠源单抗的异源性，而其中最有效的办法就是把整个抗体做成人源的，也就是全人源抗体。
全人源抗体可通过噬菌体、酵母、核糖体等展示技术；转基因小鼠及单细胞PCR 全人源单克隆抗体技术等获得（图1）。
图1 全人源抗体制备途径抗体库技术是利用基因克隆技术将全套的抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到表达载体，通过在相应表达系统表达并展示有功能的抗体分子片段，进而筛选出特异性的可变区基因的技术。
抗体库技术是一种将抗体组合文库与噬菌体、核糖体、酵母等表面展示技术相结合所形成的新技术，该技术将抗体分子展示在噬菌体等表面，并保持了抗体的天然构象和生物学活性，为进一步筛选和制备高特异性的人源抗体提供良好的技术平台。
抗体库技术与传统单克隆抗体制备技术相比，具有以下优点：1）抗体库技术省去了细胞融合的步骤，省时省力，避免了因杂交瘤不稳定而需要反复克隆化的繁琐程序。
2）扩大了筛选容量，可筛选106以上的克隆。
3）抗体库技术直接得到了抗体的基因，既没有杂交瘤丢失的问题，又便于进一步构建各种基因工程抗体。
4）抗体库技术得到的抗体可利用原核表达系统表达，比如小分子抗体scFv、Fab等可以直接利用原核系统表达。
5）可以制备一些难于制备的抗体，比如一些对小鼠毒性强的抗原，用它们直接免疫小鼠可能会造成小鼠的死亡，但用抗体库技术就没有这个问题。
噬菌体抗体库技术（图2），1985年乔治·史密斯发明的噬菌体展示的技术他也因此获得2018年诺贝尔化学奖（图3）。
该技术利用噬菌体表面展示技术，首先通过PCR扩增出抗体的全套可变区基因，并将其克隆入噬菌体展示载体中，这样抗体基因在噬菌体表面表达并展示在噬菌体表面。
再经过多轮“吸附-洗脱-扩增”的过程筛选并富集特异性抗体（图4）。
这一技术将表型和基因型联系在一起，使抗原识别能力和再扩增结合在一起，是一极为高效的表达、筛选体系。
人源化单克隆抗体PPT课件
灵长目源抗体也是 一类嵌合抗体，通过免 疫短尾猿猴产生。由于 其抗体的可变区与人可 变区无差异，不至于发 生抗体反应。
鼠源抗体
嵌合抗体
2024/1/27
2.CDR移植抗体（CDR grafted antibody)
真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区 （CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可 达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。
核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行， 用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，且能够增加表达的蛋白质的溶 解度。
2024/1/27
4.2.转基因小鼠
通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导 入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小 鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完善 的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任 何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力 的人抗体。 案例：
人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。
4.4.其他方法
XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法， 用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公 司已用此法生产出一种全人单抗。
人源化抗体的临床应用
• 近年来 ,人源化抗体和人抗体的出现为临床应 用带来了新的希望 ,当前正处于临床研究的多 种抗体中 , 嵌合抗体和 人 源 化 抗 体 所 占 比 例 大 于70 %。目前的人源化抗体 ,主要用于肿 瘤、 自身免疫性疾病和心血管疾病的治疗以 及抗移植排斥反应和抗病毒感染等方面。
(2) 鼠源性单抗在人体内生物活性降低力于人源性抗体的研究。
人源化治疗性单克隆抗体的研究进展
构建的基本思路
鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体 分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避 免诱导HAMA（人抗鼠抗体）反应。
核糖体展示技术
筛选完后，加入含20 mmol/L EDTA的冰冷缓冲液洗脱mRNA。 洗脱下来的mRNA用DNaseⅠ处理去除残留的DNA模板，进行RT-PCR( 反转录PCR）反应重新引入T7启动子和SD序列等核糖体展示必需元 件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交，评价筛选效率。将 最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接,转化到大肠杆菌中，可以 得到单个靶标克隆。进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体型) 表达方式表达单链抗体分子,进行活性鉴定。
这些研究结果说明，如果某种蛋白质的折叠 不受核糖体蛋白通道的影响，那么与核糖体的解 离就不是该蛋白获得天然构像的必要条件。2019 年，Plückthun实验室在以上研究成果的基础上 ，对Mattheakis的多聚核糖体展示技术进行了改 进，建立了体外筛选完整功能蛋白(如抗体）的 新技术：核糖体展示技术。
CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等 。
产生
Kawasaki 曾建议采用类似的途径从肽库中 筛选多肽配体。在此之前，利用前期多肽抗体 进行免疫沉淀，已经分离到了与核糖体和多肽 偶联的mRNA。Mattheakis等人首次将前人的设 想付诸实践，建立了筛选多肽类配体的多聚核 糖体展示技术，并从一个库容为10^12的肽库中 ，筛选到亲和力常数达到10^9 (nmol级) 的固 定化单抗的多肽配体。Gersuk等人利用该技术 也筛选到前列腺癌肿瘤标记的多肽配体。体外 翻译时，蛋白或多肽的折叠与翻译同步进行。 与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。
操作步骤
1.基因片段的改造 为了使基因片段能有效转录和翻译,5′端应接上
T7启动子序列和SD序列，去掉3′端的终止密码子,从 而成功地使核糖体停留在mRNA3′末端,将蛋白质和 mRNA连接在一起。在对基因片段改造时,常进行多次延 伸PCR：
核糖体展示技术
优点
• 作为一种体外展示技术，mRNA具有多 肽库容量大、筛选效率高、操作简便等 共同特点。反转录的cDNA/mRNA的杂交 双链，避免了RNA二级结构、三级结构 对体外筛选的干扰。
应用
• 主要应用于发现RNA、小分子、蛋白质 等新的蛋白质配体和阐明蛋白质与药物 在细胞中的相互作用机制。其他可能的 特殊技术主要有两类:
体内筛选技术，如噬菌体展示技术、选择性感 染噬菌体技术等。 体外筛选技术，如核糖体展示技术mRNA展示 技术
传统筛选技术的缺陷：
1必须经过细菌转化的步骤 2抗体库的容量不能超过1010 3而且在表达某些候选抗体分子时,大肠杆菌宿主 菌的生长被抑制或者由于其毒性作用而不能生长, 导致亲和筛选的偏差 4另外,亲和筛选时,具有极高亲和力的抗体分子与 抗原结合后,很难被洗脱,所以无法捕获其编码基 因。 5采用噬菌体展示技术进行抗体分子定向进化时, 除了以上各种限制之外,基因突变与表型筛选之间 的转换也很烦琐。
核糖体展示技术分类
• 1997年Pluckthun提出的以RNA-核糖体蛋白质三聚体形式的核糖体展示技术 • Roberts等设计的mRNA-多肽融合技术 • 2002年zhou JM等改进的核糖体失活展示 技术
核糖体展示技术的基本流程
First generation
mRNA-多肽融合技术的基本流程 Second generation
背景
研究证实： 体外翻译时,蛋白或多肽的折叠与翻译同步进行； 与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。 1997年, Pluckthun实验室在以上研究成果 的基础上,建立了体外筛选完整功能蛋白的新技术 ——核糖体展示技术。
核糖体筛选技术
定义：核糖体展示技术是一种筛选蛋白质强 有力的工具,通过将基因型和蛋白表型联系在 一起核 糖 体 展 示 技 术