实验三 细菌染色体DNA的提取和检测

实验三细菌染色体DNA的提取和检测

一、实验目的

学习和掌握提取细菌核酸的方法；

理解DNA电泳的基本原理和各种影响因素；

学习制胶、水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

二、实验原理

核酸存在于多种细胞，如病毒、细菌、寄生虫、动植物细胞、血液、组织、唾液、尿液等多种标本中，其分离方法是多样的。总的来说核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提，分离，纯化；乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收集。本实验细菌染色体DNA的提取主要是用溶菌酶、SDS和蛋白酶K处理细菌，将蛋白质变性使其与DNA分离。

电泳是指混悬于溶液中的电荷颗粒,在电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的现象。DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片断的分离，重组了的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA 大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：一是聚丙烯酰胺凝胶电泳：适合分离1kb以下的片断，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。二是琼脂糖凝胶电泳：可分离的DNA 片断大小因胶浓度的不同而异。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1h即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中经常使用。

三、实验材料和仪器

1、实验材料：某细菌

2、实验仪器:1.5mL离心管；枪头；移液器；摇床；台式高速离心机；电泳槽；电泳仪；微波炉；电泳板和梳子；紫外分析仪；数码相机等

四、实验试剂

（一）：

1、TE缓冲液（10：1）：10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA,pH 8.0。本次试验略去。

2、裂解缓冲液（1mL体系：40mmol/L Tris-HCl，pH8.0，40ul；2mmol/L CH3COONa，

6.6ul；1mmol/L EDTA，2ul；10%SDS，1ul；其余用水补齐）（现用现配，老师处）

3、溶菌酶：100μg/mL（已配好，老师处）

4、Proteinase K：10mg/mL （已配好，老师处）

5、10%SDS（已配好，老师处）

6、NaCl：5mol/L

7、Tris饱和苯酚（老师处加样）

8、三氯甲烷（老师处加样）

9、无水乙醇、70%乙醇（已配好，老师处）

（二）：

1、50*TAE电泳缓冲液：242.0gTris碱；100mL0.5mol.L-1/EDTA(pH8.0)；57.1mL 冰醋酸。定容1L。（老师已配好）

2、EB母液（溴化乙锭，储存液用水配制为1mg.mL-1）：称取一定量的EB溶于无菌水中，室温闭光保存；EB为强诱变剂，实验中要防止污染。（老师已配好）

3、DNA标准分子质量:购买商品

4、10*Loading buffer(pH 7.0)：购买商品

（包含：EDTA 50mmol.L-1 ；甘油 60％；Xylene Cyanol FF(W/V) 0.25％；Bromophenol Blue(W/V) 0.25％）

5、琼脂糖

五、实验步骤

（一）DNA的提取

（1）菌体培养：将此菌接种于普通液体培养基中，37℃振荡培养18h，获得足够菌体。（由老师完成）

（2）菌体收集：取1 mL培养液于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体（注意吸干多余水分）。重复一次。

（3）向每管加入200μL裂解缓冲液，用吸管头缓慢抽吸，悬浮和裂解细胞，再加入50μL，100μg/mL溶菌酶（-20度保存），缓慢抽吸，37℃处理30min。

（4）加入10μL，10mg/mL蛋白酶K，缓慢抽吸，37℃处理30min。

（5）加入66μL，5mol/L NaCl溶液，充分混匀后，12000r/min，10min。除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。

（6）将上清转移到新管中，加入等体积Tris饱和苯酚，充分混匀后，

12000r/min，5min，进一步沉淀蛋白。

（7）取离心后水层，加等体积氯仿，充分混匀，12000r/min，5min，（除苯酚。）

（8）取上清，加2倍体积预冷的无水乙醇沉淀，30min以上（时间越长越好）。之后15000r/min高速离心15min，弃上清。

（9）用200μL 70%乙醇洗涤2次，12000r/min，2min，弃上清。

（10）干燥后，20-50μL超纯水溶解DNA，-20℃放置备用。

（二）电泳检测

1、用1*TAE电泳缓冲液按照被分离DNA分子的大小配制一定浓度（1.0％）的琼脂糖凝胶30-50mL，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。(电炉，小胶是25mL)

2、用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5～1.0mm的位置上放置梳子，将温热（冷却至50℃左右）的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在3～5mm之间。

3、在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心将玻璃板移至装有1*TAE缓冲液的电泳槽中，轻轻的拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1mm。

4、DNA样品与10*Loading buffer（含有溴酚蓝和甘油等物质）混合后，用微量取样器慢慢将混合物加到样品槽中。

5、盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动，电压为80～100V。

6、溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电流，取出玻璃板。

7、溴化乙锭染色，30min以上。

8、保鲜膜垫好，在紫外灯下观察凝胶。照相。