薄层色谱实验

薄层色谱（TCL ）实验

一、实验目的

1、 掌握薄层色谱操作技巧

2、 了解薄层色谱的基本原理和应用

二、实验原理

1、原理

薄层色谱是一种微量分析的分离过程，它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上，利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处，在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。

(1) 流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相。

(2) 样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极-（诱导）-偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。

由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力程度不同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行。基于这点，TLC 系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配。

用显色试剂处理，许多组份可在日光或紫外灯光下检视。色谱可用肉眼或使用光密度计和照相机记录或影像系统方法来评价。

2、薄层色谱的用途

1）化合物的定性检验

通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定。在条件一致的情况下，纯化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离，称比移值（R f 值）。利用薄层色谱法可鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似化合物是否为同一种物质。

影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱度、活性、外界温度和展开剂纯度、组成、挥发度等。所以要获得比移值重现性就比较困难。为此，在测定某一式样时，最好用对照品和样品同时对照进行。

21d d R f 2）快速分离少量物质（几到几十u g ，甚至0.01u g ）

3）跟踪反应进程，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失，来判断反应是否完成。

4）化合物纯度的检验（只出现一个斑点，且无脱尾现象，为纯物质）

3、主要操作步骤

d 1

d 2

薄层板的制备；薄层板的活化；薄层板色谱展开；薄层色谱显色与分析。

四、薄层色谱操作技巧

1、手工自制板

1.1玻璃板的要求：用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁、平整，最好使用厚薄1~2mm 的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层板，玻璃板需洗净至不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用。玻璃板反复使用时，应注意经常用洗液及碱液清洗，保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求。

1.2制作方法：除另有规定外，将1份吸附剂加适量的水（如1份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研杵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆，立即倾入涂布器中，均匀地向前推进涂布在玻璃板上，或按照不同涂布器的规定操作涂布，涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干，再在规定的温度(一般为105℃~110℃)下活化约30分钟，贮于干燥器中备用。薄层板的厚度一般为0.25~0.5mm.。

1.3 商品化供应的预制板和高效板

板的尺寸一般有20×20cm ，10×20cm ，20×10cm，10×10cm

2、TLC/HPTLC板的预洗及活化

一般来说，色谱板应用溶剂如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更强的洗脱溶剂的混合物进行预洗。具体操作可通过空白色谱展开来实现。

色谱板预洗完后，应在105°C加热1小时进行干燥，再在室温下置放至少2小时（需采取保护措施以防止实验室空气中的污染物重新附着在其上面，如放置在空的干燥器中）。

3、样品点样

3.1点状点样和条带状点样

每次点样前，TLC/HPTLC板应在正常光线下和紫外灯下用肉眼检查薄层的损伤情况和杂质，只有无损伤、清洁的TLC/HPTLC板方可使用。

样品可进行点状或条带状点样。要想获得最佳的薄层分辨率，必须保证移行方向中的起点要小，常规的TLC薄层点状点样每次点0.5至5微升。点样量较大的样品可使用自动化装置点样，喷雾成条带状是一种可以点样量大而同时又能促成最有效分离的点样方法。在常规操作过程中，人工点样一般使用微量毛细管（0.5/1/2/3和5μl），点样时毛细管必须完全充满和完全排空，要以垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，不要损伤薄层，受损的薄层会导致溶剂不规律地流动而在色谱上产生失真的TLC谱带。

3.2 样品点样位置

起点下缘的最小距离b取决于溶剂量。两个起点之间的距离c必须令平行移行的主成份不会相互触及。点状点样时原点的直径应小于或等于3mm（高效板原点的直径应更小），条带的长度d由点样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来决定。到板侧边的距离a必须足够大以避免分离区失真变形。

4、层析

4.1展开室

4.1.1直立式双槽展开室具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点。

4.1.2 水平展开室可以从薄层板的两侧向中间水平地展开，这样可使一块薄层板所承受的样品个数比常规上行展开的薄层板增加一倍。

4.1.3 自动展开室(AMD) 可使用五种溶剂对同一薄层进行多次展开，自动控制预饱和、展开方式、展开距离和干燥条件，分离效率比传统方式提高三倍（可在80mm之内分离40种成分），符合GLP/GMP要求。

4.2 溶剂

使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”，溶剂组成采用体积量比（如正丁醇/冰乙酸/水= 4：1：1，V/V/V），或者绝对量（如18ml甲苯+ 2 ml甲醇）。其总量应足以使TLC/HPTLC 板的浸入深度约为5mm。展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用，如需分层，则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层），备用。

五、本实验操作内容

山楂有效组分熊果酸含量的鉴定。

吸附剂/快板：硅胶G3g，10ml 0.5%羧甲基纤维素钠。

供试品：取山楂0.5g，加乙酸乙酯2ml，浸泽24h，取上清液备用。

对照品：加甲醇制备成1ml含有1mg的溶液。

点样：供试品溶液点样4ul，对照品溶液点样2ul。

展开剂：甲苯/乙酸乙酯/甲酸（20：4：0.5）。

显色剂：硫酸乙醇溶液（3~10%）

显色操作：喷显色剂后，在80℃加热数分钟，至斑点显色清晰为止，置日光或紫外灯（365nm）下检测。

六、实验注意事项

1、载玻板干净且不被手污染，吸附剂在玻板上分布均匀平整；

2、点样不能戳破薄层面板，各样点间距1~1.5cm，点样直径应不超过2mm。

3、展开时，不让展开剂前沿上升至底线，否则无法准确计算R f。

4、显色加热时间不易过长，否则薄层表面易炭化而背景被污染。

七、思考题

1、如何利用R f值来鉴定化合物？

2、薄层色谱法点样时应注意什么？

3、常用的薄层色谱显色剂有那些？

（显色：展开后先烘干1.5min，喷显色剂，烘干3min左右）