免疫球蛋白的提取方法

免疫球蛋白的提取方法

根据猪血中含有的各种蛋白质的分子大小、电荷多少、溶解度以及免疫学特征等,从血液中提取免疫球蛋白,常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。

免疫球蛋白的提取盐析法盐析法是分离蛋白质的重要方法之一,是利用抗体与杂质之间对盐浓度敏感程度的差异性进行的。选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态,抗体成分呈“盐溶”溶解状态。离心去除盐析沉淀状态的杂蛋白,得到的上清液再选择一定浓度范围的盐溶液使抗体成分呈盐析状态,离心得到的沉淀物即为纯化的目标抗体。目前常用的盐析法有饱和硫酸铵分步盐析法、辛酸沉淀法、氯化铁沉淀法、多聚磷酸盐盐析法等。饱和硫酸铵分步盐析硫酸铵是盐析法最常用的无机盐,主要原因是它溶解度大,随温度变化小,对蛋白质有保护作用,高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性,价格也不贵。

免疫球蛋白的饱和硫酸铵分步盐析法操作简单,对设备和操作条件要求不高,便于工业化生产。其具体步骤为:取一定量血浆,加生理盐水稀释,边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度20%,4℃静置1h,4000r/min离心10min,弃沉淀,上清液中继续加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度50%,浓氨水调pH值至7.0,4℃静置2h,4000r/min离心20m弃上清,将沉淀溶于生理盐水,超滤除盐浓缩,滤液中无S2- 4为止,即得IgG粗提物。

免疫球蛋白的辛酸沉淀法辛酸沉淀法提取IgG时,对设备和操作条件要求较高,在离心时,转速为10000 r/min,普通离心机达不到要求。在调节溶液pH值时,要控制得当,pH值稍低或稍高对IgG的得率和纯度都有很大影响,这些都限制了它的广泛应用。其具体步骤为:取一定量0.1mol调pH值至4.5;室温下边搅拌边缓慢加入辛酸(按辛酸25 μl/mL血清混合液添加),继续搅拌30min 后,10000r/min离心30min,弃沉淀,留上清液,上清液用多层纱布过滤,留滤液,然后将滤液装入透析袋中析48h,每8～10h换一次透析液,最后超滤浓缩即得1gG粗提液。

免疫球蛋白的氯化铁沉淀法氯化铁沉淀法的原理是据蛋白质分子与金属离子反应形成盐复合物的形式和种类的不同,达到分离不同蛋白质的目的。其具体步为:取一定量的血浆(加抗凝剂),用生理盐水稀释后,边搅拌边缓加入三氯化铁溶液,调pH值至4.5,搅拌混,40℃水浴保温60min后,4000r/min离心15min,弃去沉淀,上清液调pH值至9.0,常温静置2h,离心去沉淀过滤,上清液经超滤浓缩即得IgG粗提。

免疫球蛋白多聚磷酸盐盐析法多聚磷酸盐作为一种食品添加剂,常被添加在肉制品中以提高产品的保水性或者作为絮凝剂在食品加工中使用。多聚磷酸盐作为沉淀剂具有安全和高效的特点,是解决猪血清IgG大规模分离制备有效途径之一,但目前尚未有深入系统的研究。其具体步骤为:取一定量的血清加入相应量的多聚磷酸盐溶液,以0.1mol/L盐酸调至所需pH值,在一定温度水浴中保温反应一段时间后,取出8000r/min离心10min,弃沉淀,收集上清液,即为IgG粗提液。

免疫球蛋白的有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法广泛用于生产蛋白质制剂,常用的试剂是丙酮和乙醇等,其中以乙醇最为常用。目前,国际上常用冷乙醇法有两种,一种是美国等国主要使用的Cohn-Oncley法,另一种是西欧等国主要使用的Kistler和Nitschmann法。冷乙醇分离法是WHO规程和中国生物制品规程推荐用的方法,不仅分离物质多,可同时分离多种血浆成分,分辨率高,提纯效果好,而

且有抑菌、清除和灭活病毒的作用,但是要需要在低温下操作,一定程度上限制了它在工业化生产中的应用。