甲状腺功能的实验室检测的原理及方法

甲状腺功能的实验室检测的原理及方法甲状腺功能实验室检查主要包括甲状腺激素、促甲状腺激素、甲状腺激素结合球蛋白和相关自身抗体检测。目前认为，联合进行游离三碘甲状腺原氨酸，游离甲状腺素和超敏促甲状腺激素测定，是甲状腺功能评估的首选方案和第一线指标。甲状腺激素的测定多采用免疫分析法，但传统的放射免疫法灵敏度有限，不能区别正常人低值和原发性甲亢。化学发光免疫法和时间分辨荧光免疫法都更为灵敏、准确，其检测限可达0.001mIU/L。但无论检测方法灵敏度多高，结果多准确，都必须结合临床和其他甲状腺功能检查才能做出正确诊断和治疗决策。

一、甲状腺素

甲状腺素（thyroxine，T4）检测具有多种方法，传统检测方法采用放射性碘标记的放射免疫法。但其操作过程繁琐，在临床应用中受到一定限制。时间分辨荧光免疫法和电化学发光法均是目前最先进的标记免疫测定技术，其检测快捷，敏感度高，近年来在临床T4 检测中被广泛应用。时间分辨荧光免疫法测定血清总甲状腺素如下：

1.原理

加入待测血清、铕标记T4和鼠抗T4的单克隆抗体（单抗）温育，试剂中的8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）能将结合状态的T4游离出来。抗

T4单抗和包被在微孔板上的二抗结合的同时，样本中的T4和铕标记T4竞争结合抗T4单抗上的结合位点，温育后洗板，加入解离增强液将标记在复合物中的铕离子解离至溶液中，与增强液中的有关成分形成荧光螯合物微囊，发出的荧光强度与样品中的总甲状腺素（total thyroxin，TT4）浓度成反比。

2.试剂与仪器

购买成套的商品试剂盒，主要成分如下：已包被第二抗体的96微孔反应板，T4标准品（6瓶，分别含0、20、50、100、150和300nmol/L 的T4标准品），抗T4单克隆抗体（含ANS），铕标记T4（含ANS），浓缩洗液（25×），缓冲溶液，增强液。

3.操作

（1）试剂准备：

1）洗涤液：40ml浓缩洗液加960ml蒸馏水混合（pH 7.8）。

2）铕标记T4：使用前1小时内配制，每条反应板需30μl铕标记T4加3ml缓冲液。

3）抗T4单克隆抗体工作液：30μl抗T4单抗加3ml缓冲液。

（2）洗板1次，拍干。

（3）吸取25μl T4标准品或待测血清按顺序加入微孔反应板的小孔中。

（4）每孔加200μl已稀释的铕标记T4

和抗T4单抗工作液。用振荡器振荡90分钟，注意不要超过2小时。洗板4次，拍干。

（5）每孔加入增强液200μl。微孔反应条在振荡仪上振荡5分钟。用时间分辨荧光检测仪检测。

4.计算

以T4标准品的浓度对数值为横坐标，荧光强度为纵坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，根据样品的荧光强度即可查出相应的

T4

浓度，此步骤通常由时间分辨荧光测定仪按设定模式自动完成，直接打印、报告结果。

5.参考区间

成人血清TT4：69.0～141.0nmol/L。

6.方法学评价

（1）认真阅读说明书，严格按照说明书操作。不同批号的试剂不可混用，过期的试剂不可使用。

（2）实验室环境干净无尘，对于试验成功有决定性的意义。

（3）每批检测时最好用复孔作标准曲线。

（4）试剂和检样使用前应恢复至室温（18～25℃）。

（5）洗板机应定期进行校正，保证管道通畅。洗涤时，确认微

孔注满洗液；洗涤完成后保证微孔残留液不＞5μl；并将微孔板倒扣于无尘吸水纸上拍干。

（6）加增强液及铕标记物时，请使用专用吸头，以避免污染。

加增强液及中和抗原是，吸头应悬空，避免接触小孔边缘及其中的试剂。

（7）使用干净一次性容器配制铕标记物，不同试验的铕标记物

不可混用。避免铕标记稀释液进入铕标记物原液中。若对试验结果有疑问，应重复试验。

二、三碘甲状腺原氨酸

T4的含量是三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）含量的4倍左右，然而T3的作用却是T4的十倍左右。T3在判断机体生理、

病理状况上扮演重要角色，所以检测血清中T3含量有重要意义。采

用时间分辨荧光免疫法和电化学发光测定T3具有灵敏度高、线性范

围宽、无放射性危害等优点。时间分辨荧光免疫法测定血清总三碘甲腺原氨酸如下：

1.原理

本法测定血清总三碘甲腺原氨酸（total triiodothyronine，TT3）的原理同时间分辨荧光免疫法测定血清TT4。

2.试剂与仪器

购买成套的商品试剂盒，主要组成同时间分辨荧光免疫法测定血

清TT4。

3.操作

同时间分辨荧光免疫法测定血清TT4。

4.计算

同时间分辨荧光免疫法测定血清TT4。

5.参考区间

成人血清TT3：1.3～2.5nmol/L。

6.方法学评价

参见时间分辨荧光免疫法测定血清T4。

三、游离T3和T4测定血清游离T3和T4的浓度是区别

甲亢、甲低、亚临床异常状态等甲状腺功能的灵敏指标。其测定的准确性、快速性直接关系到临床诊断及用药。游离T3和T4检测多采用放射免疫法，而近年发展起来的时间分辨荧光免疫法和化学发光法，因其快速、准确、重复性好及试剂安全、无放射性污染等特点，在临床检测中已得到广泛认可。化学发光免疫法测定血清游离T3和T4如下：

1.原理

本方法为化学发光免疫法的竞争法，即使用过量的碱性磷酸酶标记抗原（ALP-FT3或ALP-FT4）与待测血清中未标记抗原（FT3

或FT4）在反应体系中竞争结合特异性抗体的结合位点。当反应达到平衡时，加入连接有羊抗鼠IgG抗体的磁性颗粒，可捕获ALP-FT3 （FT4）-Ab抗原抗体复合物，在磁场的作用下自行沉淀。经洗涤并吸弃废液后加入发光底物AMPPD，后者在ALP的作用下，迅速发出稳定的光量子。

2.试剂与仪器

购买与仪器配套的商品成套试剂盒。

3.操作

按仪器操作说明书进行，只需分离血清上机，包括加样、分离、搅拌、温育、打印结果在内的各项操作均由仪器自动进行。

4.参考区间FT3：3.67～10.43pmol/L；FT4：11.2～20.1pmol/L。

5.方法学评价

（1）待测标本及试剂上机前注意恢复至室温。

（2）测定标本严重溶血影响结果。标本应置-20℃存放，并避免反复冻融。

（3）不同批号的试剂不能混用，每批试剂应分别制作标准曲线。

四、促甲状腺素（TSH）

促甲状腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）是反映甲状腺功能最敏感的指标。血清TSH测定方法有多种，从较早的放射免疫