流式细胞仪SOP示例

相关主题

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

流式细胞仪操作规程目录

1：淋巴细胞亚群测定

2：HLA-B27测定

淋巴细胞亚群测定

(CD系列)

方法

流式细胞仪BD)

原理：

用已知总数的荧光微球Beads作标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式细胞仪的获取和分析软件，就可以得出血中CD3、CD4，CD8、B、NK细胞的绝对数。

细胞（/ul）=获取细胞数×Beads总量Beads获取数×样本量

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位静脉采血

抗凝剂 EDTA抗凝血

要求 1．样本量至少1ml。

2．室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。

3．溶血样本不能用。

试剂

(1)

质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

样本制备：

1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照

2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）

报告结果

报告百分数（和绝对值）

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值(百分数（绝对值）)

CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072)

CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)

Th/Ts 1.05-2.03

临床意义

1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。

临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。

Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。

Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。

2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。

方案（Protocol）

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分 1：单克隆抗体液体 1ML 2—8℃

2：全血溶血试剂液体

A：甲酸液体 70ML 室温

B：碳酸钠等液体 32ML 室温

C：多聚甲醛液体 14ML 室温

3：鞘液液体 20L 室温

4：清洗液液体 5L 室温

5：荧光微球液体 10ML 2-8℃