实用文库汇编之石蜡切片和冷冻切片
石蜡切片
石蜡切片（paraffin section）技术相关内容组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。
活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织***，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。
石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。
一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
1.取材应根据要求选取材料来源及部位。
例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。
材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。
2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。
固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。
固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。
例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。
固定液可分为单一固定液及混合固定液。
前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。
石蜡切片VS冰冻切片
石蜡切片V S冰冻切片石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。
制作过程较石蜡切片快捷、简便，因而多应用于手术中的快速病理诊断。
实验步骤一、石蜡切片1.?固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
?4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5.包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6.切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7.贴片与烤片：一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
8.切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9.染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
石蜡切片与冰冻切片
石蜡切片与冰冻切片一、组织和细胞标本类型：（一）组织标本类：1、石蜡切片：组织形态保存好2、冰冻切片：抗原性保存好（二）细胞标本类：1、组织印片2、细胞培养片（细胞爬片）3、细胞涂片二、组织取材1、脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。
2、组织取材注意事项：（1）标本新鲜：组织要求离体后30min~2h内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。
动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。
（2）注意防止人为因素的影响刀和剪要快，避免挤压。
（3）组织块的大小厚为0.1~0.3cm，大小可根据需要而定。
三、活细胞标本的制备法（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。
（2）将细胞直接培养在盖玻片上。
（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。
四、石蜡切片的制备1、由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。
因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需用乙醇类试剂进行脱水，水脱完后，组织内含有大量的乙醇，还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换，最后经浸蜡，组织细胞内被大量石蜡支称，才使组织能用于石蜡切片。
2、小动物组织脱水、透明和浸蜡时间75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min；二甲苯Ⅰ15min，Ⅱ10min，Ⅲ10min；石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1~2h。
五、冰冻切片的保存和使用1、冰冻切片固定后-80℃保存备用2 、冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。
石蜡切片、冰冻切片实验技术服务
石蜡切片、冰冻切片实验技术服务
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。
制作过程较石蜡切片快捷、简便，因而多应用于手术中的快速病理诊断。
【技术原理】
组织经固定后，含有大量水分，使用乙醇从低浓度到高浓度将组织内的水分逐渐置换出来，以利于透明剂和石蜡的进入，这个过程称为脱水。
组织脱水后，必须经过一种既能与乙醇相结合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用使石蜡浸入组织，这种溶剂使组织呈现出不同程度的透明状态，这个过程称为透明。
组织经过脱水、透明后用石蜡作为支持剂浸入组织内，使组织变硬并将组织包裹在内，有利于切片，这个过程称为浸蜡。
浸蜡后的组织块用石蜡包成块，使组织达到一定的硬度和韧度有利于切片。
【实验流程】
案例展示
技术总结
【常见问题】
1、切片上卷或皱起
切片刀角度过大或过小，调整角度以5°为宜。
2、切片有空洞及破碎不齐
切片时慢一点，轻削组织。
3、切片有褶皱
切片时对准蜡块表面轻轻哈气。
【注意事项】
1、组织硬度较大，容易发生切片碎裂，需经软化或脱钙；
2、摊片时间过长，组织中心易开裂；
3、摊片时间过短，组织有褶皱，影响后续染色拍照；
4、特殊组织的切片，在后续染色过程中容易出现掉片的情况，比如皮肤、脑组织；
5、切片太厚，容易导致染色程度过深。
关于术中冰冻切片与石蜡切片诊断的对比研究
关于术中冰冻切片与石蜡切片诊断的对比研究摘要：目的：研究与分析术中冰冻切片与石蜡切片在诊断工作中的效果情况。
方法：选择我院在2019年1月-12月接收的100例患者，按照诊断方式，将其分为对照组与实验组，进行对比分析。
结果：从相关数据可知，两组患者都能够有效地诊断出患者的病变情况，对于患者的健康来讲，冰冻切片能够有效的确认其实际情况，两组患者不具有差异，（P>0.05）。
结论：术中冰冻切片能够获准确的对患者情况作出判断，对于患者的病情诊断具有更加积极的意义，可以有效的确定患者实际情况，对于患者的健康具有更大程度的帮助，虽然依旧存在一定的误诊率与漏诊率，但是其能够缩短诊断时间，帮助医师更快的制定诊断方案，所以值得在临床中推广使用。
关键词：术中冰冻切片；石蜡切片；癌症诊断冰冻切片是一种通过低温坏境使人体组织变硬到一定程度后，进行切片的方式，这一方式能够在手术的过程中，及时有效的判断病变的位置与其种类，能够为手术方式的选择更快的提供帮助。
从相关研究与分析来讲。
术中冰冻切片能够为其提供非常大的帮助，可以有效的诊断出患者的患病情况，但是在任何诊断方式使用的过程中，都存在一定程度的误诊与漏诊的情况，而提高其准确性有成为研究工作中的重点。
在本次分析工作中，对术中冰冻切片与石蜡切片进行了对比分析，现总结如下。
1.资料与方法1.1一般资料选择我院在2019年1月-12月接收的100例患者，患者均为乳腺癌患者。
按照诊断方式，将其分为对照组与实验组，其中对照组患者50例，年龄为24-56岁，平均（35.6±2.4）岁，实验组患者50例，年龄为23-56岁，平均（35.62±2.1）岁。
纳入标准为，符合临床诊断要求，年龄处于研究范围。
排除标准为，患有其他器官疾病或是精神疾病等。
两组患者均签订了知情同意书，并且实验通过了医院伦理委员会的同意。
两组患者在一般资料方面无差异，（P>0.05），可以进行比较。
病理切片储存与管理规范
病理切片储存与管理规范病理切片是病理学研究和临床诊断的重要依据，对于疾病的准确诊断、治疗方案的制定以及医学研究都具有极其重要的意义。
因此，规范的病理切片储存与管理至关重要，它不仅能够保证切片的质量和完整性，还能提高工作效率，为医疗工作提供可靠的支持。
一、病理切片的分类病理切片通常分为石蜡切片、冰冻切片和细胞学涂片等。
石蜡切片是经过固定、脱水、透明、浸蜡和包埋等一系列处理后制成的，具有较好的组织结构保存效果，是最常见的病理切片类型。
冰冻切片则是在手术中快速制作，用于术中病理诊断，但其保存时间相对较短。
细胞学涂片主要用于细胞形态学的观察，如宫颈涂片、胸水涂片等。
二、储存环境要求1、温度和湿度病理切片的储存环境应保持温度在 18-25℃，相对湿度在 40%－60%。
过高或过低的温度和湿度都会影响切片的质量，导致切片变形、干裂或发霉。
2、通风与防尘储存室应保持良好的通风，以防止有害气体的积聚。
同时，要采取有效的防尘措施，避免灰尘污染切片。
3、光照应避免切片直接暴露在阳光下或强光照射，以免导致切片褪色。
三、储存设备1、切片柜切片柜应采用防火、防潮、防虫的材料制作，内部结构合理，便于切片的分类存放。
每个抽屉应标明切片的编号、患者姓名、病理诊断等信息。
2、玻片盒玻片盒应选用质量良好、无腐蚀性的材料，能够有效保护切片不受损伤。
玻片盒上也应标注相关信息。
四、切片的编号与标识1、编号系统建立科学合理的编号系统，确保每个切片都有唯一的编号。
编号应包含患者的基本信息、取材部位、病理类型等，以便于查找和识别。
2、标识内容切片上的标识应清晰、准确，包括患者姓名、病历号、取材日期、切片类型等。
同时，在切片的包装和储存位置上也应标注相应的信息。
五、切片的入库与登记1、入库检查切片制作完成后，在入库前应进行质量检查，确保切片完整、无损坏、染色清晰。
2、登记信息详细记录切片的入库信息，包括编号、患者信息、诊断结果、储存位置等，建立完善的入库登记台账。
冰冻切片与石蜡切片的区别
1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。
其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性,尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。
冰冻时，组织中水份易形成冰晶,往往影响抗原定位。
一般认为冰晶少而大时,影响较小,冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。
冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率)成反比,即冰晶形成的数量愈多则愈小,对组织结构影响愈严重。
因此,应尽量降低冰晶的数量。
Fiｓh认为冰冻开始时,冰晶成核率较慢,以后逐渐增加，其临界温度为-3３。
C，从-3０。
C降至-43。
C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。
基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。
(1)速冻,使组织温度骤降，缩短从-３３。
C43。
C的时间,减少冰晶的形成。
其方法有二：①干冰-丙酮（酒精)法：将15０－２00ｍｌ丙酮(酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰,直至饱和呈粘稠状,再加干冰不再昌泡时,温度可达-７0℃C，用一小烧杯(50－100ml)内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮(纯酒精)饱和液内,至异戊烷温度达-7０℃时即可使用。
将组织(大小为1cm×0.8ｃｍ×0.5cm）投入异戊烷内速冻３０-6０s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。
②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约２cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-2０s组织即迅速冰结成块。
取出组织冰块立即置入－80℃冰箱贮存备用,或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
（2)将组织置于20%-30%蔗糖溶液1~３天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。
石蜡切片冰冻切片超薄切片
石蜡切片技术虽然21世纪医学高科技迅猛发展、日新月异，新的诊断方法层出不穷，但迄今为止，即使是世界上最发达国家，疾病的确诊主要还是通过病理诊断。
病理诊断是所有其他诊断(包括临床诊断、影像诊断、实验室检查诊断乃至分子诊断)的金标准。
因此学习相关病理诊断技术具有重要意义。
病理技术不仅可以作为临床诊断的金标准，还可以帮助临床查明死因，对研究生来说还可以提供教学、科研的资料。
病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖，大体标本的制作、制片技术（石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、半薄切片、超薄切片）组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等。
硕士研究生学习的课题研究阶段，往往需要自己设计并亲自动手操作，为满足研究生的实际需要，本章简要介绍常用的病理学有关技术，并注意尽量做到：①突出实用性：以行之有效的病理学常用技术为主线，围绕硕士研究生的实际需要，对病理学技术的原理、相关理论及具体操作方法、步骤等进行阐述。
②反映进展性：充分反映病理学的时代性与进展性。
第一节组织制片的概述组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。
最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。
组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展。
切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。
因此，组织制片技术是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。
第二节制片的种类一、组织切片法：任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以μm计），再进行染色而得到结果。
在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。
渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等。
术中冰冻与石蜡切片诊断准确性分析
XX医院病理科2010～2012年术中冰冻与石蜡切片诊断准确性分析肿瘤手术中冰冻切片快速病理诊断具有十分重要的意义，它不仅是鉴别良、恶性肿瘤准确快速的方法，也是指导临床医生决定手术切除范围及制定下一步治疗方案的关键手段。
比较冰冻切片快速病理诊断与石蜡切片病理诊断的符合率，分析可能导致误诊的原因。
现对我科2010年１月～2012年5月间所有冰冻切片诊断工作进行回顾性分析。
一、材料与方法为防止制成的冰冻切片镜下组织形态发生改变，送检标本要求用干纱布包裹或置于不加任何液体的洁净容器内及时送达病理科，病理医师详细检查大体标本后取肉眼确认病变最明显区域1～2块组织，迅速置全自动恒冷切片机（英国产SHANDN ）上制作切片。
切片厚4μm，经酒精固定，HE染色，普通光镜（Olympus BX41）下观察。
二、结果三、讨论冰冻切片与石蜡切片诊断的符合率逐年有所提高，说明我科病理医生对冰冻切片诊断的知识面及经验都有所提高。
误诊原因分析1、科外因素：⑴.术中标本送检时放入生理盐水或其它液体中，或用湿纱布包裹标本，或术者用水冲洗标本等，做冰冻切片时由于骤冷产生大量冰晶使组织呈空网状，使病理医师误认为是粘液或脂肪组织来源的肿瘤，被迫第二次取材。
⑵.手术医师取材不当或取材错误，可造成冰冻切片诊断的准确率和预测值之间的差异，如滑膜肉瘤送检组织为纤维结缔组织；胰腺癌时切取正常胰腺组织送检；脑胶质瘤送检脓性坏死渗出物，从客观上导致假阴性。
⑶.有些病变由于组织结构的特殊性，冰冻切片很难确诊，例如：①乳腺硬化性病变，包括某些类型的腺病（硬化性腺病）及放射状瘢痕。
有人认为良性硬化性病变与硬癌的鉴别很困难，在冷冻切片中尤其如此。
我们曾遇见过乳腺硬化性腺病的假浸润现象而诊断为乳腺癌的病例。
②乳腺乳头状病变，包括导管内乳头状瘤与末梢导管的乳头状瘤病。
③乳腺导管上皮增生性病变，包括不典型增生。
本组有一例导管上皮增生呈“搭桥”样生长，并形成不规则的间隙，误诊为恶性。
浅谈两种常用组织切片技术
浅谈两种常用组织切片技术组织学常规制片技术中常见的有石蜡切片和冰冻切片两种其中以石蜡切片最基本最经典最广泛而目前冰冻切片因简便用时短等特点在临床上也倍受青睐本文结合笔者多年的实践经验就石蜡切片与冰冻切片的制作技术论述如下石蜡切片制作石蜡切片法从取材固定洗涤和脱水透明浸蜡包埋切片与粘片脱蜡染色脱水透明封片等步骤一般需要周的时间但标本可以长期保存使用为永久性显微玻片标本固定固定液的种类很多甲醛是病理切片常规使用的固定液不仅适用于常规染色还可以用于组织学其他技术的切片染色组织块一般不宜过大固定液的用量通常为组织块的倍左右固定时间通常为数小时至脱水为了减少组织材料的急剧收缩应进行从低浓度到高浓度递增的顺序进行梯度脱水常从直至纯酒精无水乙醇每次时间根据组织块的大小来定常为数小时如不能及时进行各级脱水材料可以放在酒精透明二甲苯是石蜡的溶剂常用的透明剂通常将组织块置于纯酒精和二甲苯的混合液浸再转入纯二甲苯中浸浸时间则要根据组织材料块大小及性质而定如果透明时间过短则透明不彻底石蜡难于浸入组织透明时间过长则组织硬化变脆就不易切出完整切片最长为浸蜡蜡的温度不能太高比蜡的熔点高即可蜡熔化后应在蜡箱内过滤掉杂质后使用浸蜡的时间由组织块大小油脂性确定块小没有油脂的时间短些块大有油脂的时间长些切片切片刀的锐利与否蜡块硬度适当都直接影响切片质量可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度通常切片厚度为可切连续薄片粘片将组织石蜡切片在温水中展片水温要适中温度过高切片熔化温度过低则切片不能展开一般在左右用甲醛明胶处理过的载玻片捞片粘片的时候注意不要产生气泡脱蜡切片经下行梯度脱蜡后方可进行染色冰冻切片制作冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性固定新鲜组织取材后甲醛固定固定后入蔗糖溶液浸泡至组织块沉底温度恒冷箱切片机应长期处于待机备用状态箱内温度维持在左右组织块在箱内冰冻时间不易过长否则组织易碎每种组织都有自己的合适切片温度细胞较丰富组织如肝肾淋巴结等切片温度应在左右软组织脂肪类组织切片温度应在左右含大量脂肪的组织应调至切片切片时进刀的速度应均匀平稳速度过慢切片增厚容易脱片速度过快组织易磕掉贴片时要依靠载玻片的热量将组织吸附上来尽量保证切片时组织的完整性讨论两种方法中石蜡切片能切成连续薄片组织细胞结构清晰保存良好在病理和回顾性研究中有较大的实用价值但石蜡切片步骤繁多在制片过程中要经过酒精二甲苯等有机溶剂处理组织内抗原活性失去较多冰冻切片手续简便时间短制片过程中抗原活性丢失少组织变化不大能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差酶保存较好但冰冻切片不容易做切取的组织块不能过大组织过大不容易冻结或者组织冻结不均影响切片及染色效果不容易制作较薄的切片组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位并且组织结构也不如石蜡切片清晰在实验过程中如何恰当使用各种切片技术还需不断摸索参考文献高艳冰冻切片的制作方法探讨云南医药章克萍周莹龙飞不同组织冰冻切片的制作方法江西医学院学报胥维勇杨群影响冷冻切片质量的因素中国组织化学与细胞化学杂志。
冰冻切片与石蜡切片的区别
1．冰冻切片是免疫构造化教染色中最时常使用的一种切片要领.其最超过的便宜是不妨较完佳天保存多种抗本的免疫活性，越收是细胞表面抗本更应采与冰冻切片.新陈的构造及已牢固的构造均可做冰冻切片.之阳早格格创做冰冻时，构造中火份易产死冰晶，往往做用抗本定位.普遍认为冰晶少而大时，做用较小，冰晶小而多时，对于构造结构益伤较大，正在含火量较多的构造中上述局面更易爆收.冰晶的大小与其死少速率成正比，而与成核率（产死速率）成反比，即冰晶产死的数量愈多则愈小，对于构造结构做用愈宽沉.果此，应尽管落矮冰晶的数量.Fish认为冰冻启初时，冰晶成核率较缓，以来渐渐减少，其临界温度为-33.C,从-30.C 落至-43.C之间，成核率慢遽减少达1018，而后再减缓.鉴于上述表面可采与以下步伐缩小冰晶的产死.（1）速冻，使构造温度骤落，支缩从-33.C43.C的时间，缩小冰晶的产死.其要领有二：①搞冰-丙酮（酒粗）法：将150-200ml丙酮（酒粗）拆进小保温杯内，渐渐加进搞冰，曲至鼓战呈粘稀状，再加搞冰出有再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内拆同戊烷约50ml，再将烧杯缓缓置进搞冰丙酮（杂酒粗）鼓战液内，至同戊烷温度达-70℃时即可使用.将构造（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）加进同戊烷内速冻30-60s后与出，或者置恒热箱内以备切片，或者置-80℃矮温冰箱内贮存.②液氮法：将构造块仄搁于硬塑瓶盖或者特造小盒内（曲径约2cm），如构造块小可适量加OCT包埋剂浸出构造，而后将特造小盒缓缓仄搁进衰有液氮的小杯内，当盒底部交触液氮时即启初气化沸腾，此时小盒脆持本位切勿浸进液氮中，约莫10-20s构造即赶快冰结成块.与出构造冰块坐时置进-80℃冰箱贮存备用，或者置进恒热箱切片机冰冻切片.（2）将构造置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用下渗吸支构造中火分，缩小构造含火量.做用冰冻切片的果素较多，果此，技能易度较大，采用佳的冰冻切片机是包管切片品量的关键.久时冰冻切片机有二类：①恒缓冰冻切片机（Cryastat）：为较理念的冰冻切片机，型号很多，但是其基础结构是将切片机置于-30℃C矮温稀关室内，故切片时出有受中界温度战环境做用，可连绝切薄片至2-4μm，真足能谦脚免疫构造化教标记表记标帜央供.切片时，矮温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过矮构造易破碎，抗卷板的位子及角度要适合，载玻片附揭构造切片，切勿上下移动.②启搁式冰冻切片机：包罗半导体致热切片机战甲醇致热切片以及老式的CO2、氯乙烷等热冻切片机.切片时表露气氛中，温度出有简单统造，切片技能易度大，正在下温季节，切片越收艰易，且切片薄8～15μm，出有简单连绝切片，但是其便宜是价廉，海内有死产.冰冻切片后如出有染色，必须吹搞，贮存矮温冰箱内，或者举止短促预牢固后贮存冰箱保存.2．石蜡切片其便宜是构造结构保存良佳，正在病理战回瞅性钻研中有较大的真用价格，能切连绝薄片，构造结构浑晰，抗本定位准确.用于免疫组化技能的石蜡切片造备与惯例造片略有分歧：①脱火、透明等历程应正在4℃.C下举止，以尽管缩小构造抗本的益坏.②构造块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm，使构造充分脱火、透明、浸蜡.③浸蜡、包埋历程中，石蜡应脆持正在60℃以下，以溶面矮的硬蜡最佳（即矮温石蜡包埋）.构造块脱火、透明、浸蜡时间参照表1-3：表1-3 构造块处理时间表1 70%乙醇4℃ 3～4h2 80%乙醇4℃ 3～4h3 90%乙醇4℃ 2～3h4 95%乙醇Ⅰ 4℃ 2～3h5 95%乙醇Ⅱ 4℃ 1～2h8 二甲苯Ⅰ 4℃ 0.5～1h9 二甲苯Ⅱ 4℃ 0.5１～1h10 石蜡Ⅰ 60℃ 1h11 石蜡Ⅱ 60℃ 2h以上齐历程为18-24h，也可正在室温内使用自动脱火机代替.如构造块小，曲径小于0.5cm，可用赶快石蜡包埋切片，齐历程只需4h安排.石蜡切片为惯例造片技能，切片机多为轮转式，切片薄度2～7μm，应用范畴广，出有做用抗体的脱透性，染色匀称普遍.由于甲醛牢固、有机熔剂战包埋剂对于组抗本有一定的益伤及遮蔽，使抗本特性爆收改变.有人报告经蛋黑酶消化，不妨革新光镜免疫组化染色强度，时常使用的有胰蛋黑酶、链霉蛋黑酶及胃蛋黑酶等消化法.石蜡切片应进37℃恒温箱过夜，那样烤片可缩小染色中脱片局面.切片如需少久贮存，可存搁于4℃冰箱内备用.石蜡切片便宜较多，但是正在造片历程中要通过酒粗、二甲苯等有机溶剂处理，构造内抗本活性得来较多，有人采与热冻搞燥包埋法（Freeze drying embedding methed），不妨保存构造内可溶性物量，预防蛋黑变性战酶的得活，进而缩小了抗本的拾得.该法是将新陈构造矮温速冻，利用热冻搞燥机（Freezing dryer）正在真空、矮温条件下排除构造内火分，而后用甲醛蒸气牢固搞燥的构造，末尾将构造浸蜡、包埋、切片.此法可用于免疫荧光标记表记标帜、免疫酶标记表记标帜及搁射自隐影.。
石蜡切片和冷冻切片
石蜡切片和冷冻切片——傻傻分不清楚系列之迟辟智美创作在组织实验中，组织切片和冷冻切片是最罕见的两种切片方法，两种优缺点明显，在实验的应用上也年夜有分歧.而两个实验的相同点都是应用免疫学基来源根基理——即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标识表记标帜抗体的显色剂显色来确定组织细胞内卵白质，对其进行定位、定性及相对定量的研究.一、石蜡切片组织学惯例制片技术中最为广泛应用的方法.石蜡切片不单用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变动的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中.1、固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜.凝固组织中的物质成份，尽可能坚持其活体时的结构.同时能使组织硬化，有利于切片的进行.2、脱水：为了减少组织资料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时.固定后的组织资料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果.3、透明：经常使用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂.纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精.资料块在透明剂浸渍过程称透明.4、浸蜡：先把组织资料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时.先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右.5、包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定.6、切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度.通常切片厚度为5微米，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片.7、贴片与烤片：将水浴中展片捞至玻片上铺正，然后将载玻片放入37℃温箱中干燥.8、切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递加的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化.9、染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，大都细胞质及非细胞成份被伊红染成粉红色.实验把持简单.免疫组化：指带显色剂标识表记标帜的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应.二、冰冻切片：冰冻切片是一种在高温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法.制作过程较石蜡切片快捷、简便，因多应用于手术中的快速病理诊断.一、取材：应尽可能快地采用新鲜的资料，防止组织发生死后变动.二、速冻：1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）.2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内.3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒坚持原位切勿浸入液氮中，年夜约10-20s组织即迅速冰结成块.4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片.5、若需要保管，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用.三、固定：1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织.2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻.3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min.四，切片：1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于高温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm.2、切片时，高温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温渡过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动.3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min.PBS洗5min×3.4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却.可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性.五、免疫荧光染色：1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）.2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织年夜小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）.3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜.4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片拔出到小染缸PBS冲刷.5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时.回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次.6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）.7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处置干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照.8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保管一周左右.比较：。
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别一、石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片(section)。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为5～7um，也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um。
切好的蜡带，放人40℃左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在30％的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45～50℃的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片，可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基—乙氧基甲硅烷等处理。
二、冰冻切片冰冻切片(fiozen section)是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1．防止组织中冰晶形成的方法(1)速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1)干冰—丙酮(乙醇)法：将150～200ml丙酮(无水乙醇)装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70℃，用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰—丙酮(或无水乙醇)饱和液内，至异戊烷温度-70℃时即可使用。
石蜡切片和冷冻切片制作流程
石蜡切片和冷冻切片制作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!一、石蜡切片制作流程1. 取材：从生物体上取下需要观察的组织或器官，切成适当大小的块状。
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别一、石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片（sectio n）。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为 5〜7um也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um切好的蜡带，放人40C左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在 30%的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45〜50C的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片, 可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基一乙氧基甲硅烷等处理。
二、冰冻切片冰冻切片（fiozen section）是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1 •防止组织中冰晶形成的方法（1）速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1）干冰一丙酮（乙醇）法：将150〜200ml丙酮（无水乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70 C,用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰一丙酮（或无水乙醇）饱和液内，至异戊烷温度-70 C时即可使用。
冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处
了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。
编辑本段
编辑本段编辑本段
编辑本段冰冻切片的应用
新鲜的组织制备
组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2
气（－78℃） ② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃） ③ 液
氮（－190℃）④ 液氮冷却的丙烷（－19℃）。液氮适用于组织化学，较安
全。缺点：组织块易发生龟裂。
④ 分化。
⑤ 于碱水中返蓝20秒。
⑥ 伊红染色10－20秒。
⑦ 脱水，透明，中性树胶封固。
冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在
10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。 冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化
据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋
巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、
肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃
左右，切含大量的脂肪时
切含大量的脂肪时切含大量的脂肪时
切含大量的脂肪时，
（
（（
（二
二二
二）
））
）缺点
缺点缺点
缺点：
：：
：
1．不容易做连续切片。
2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响
切片及染色效果。
3．不容易制作较薄的切片。
4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原
石蜡切片与冰冻切片的优缺点
两种切片我都做得比较多。
相比之下，我更喜欢石蜡切片。
石蜡切片的最突出优点是标本可以长期保存。
在这次试验结束的若干年后，还可以用来做别的指标。
对于比较珍贵的标本，如罕见的临床标本，石蜡切片是比较好的选择。
我觉得石蜡标本的好坏取决于固定的质量。
个人认为组织块不宜过大，固定时间不宜过长。
我的经验是取火柴头大的组织，4%多聚甲醛或10%福尔马林4摄氏度固定3-4小时。
固定时间太长的话，蛋白质的肽链过度扭曲，抗原决定族被缠绕包裹，不容易做出结果。
石蜡切片的主要缺点是不适合做荧光。
我也不知道为什么，反正我老板是这么说的。
可能是由于石蜡有自发荧光的缘故。
我也试过用石蜡切片做荧光，效果还可以。
可是文章中这么做的确实很少。
冰切相对简单，容易出结果。
大多数人是用新鲜组织直接冰切，然后丙酮固定。
这样做虽然省事，可固定完了以后要马上漂洗、孵抗体或染色，不能让切片晾干，不然形态会非常糟糕。
我喜欢先用4%多聚甲醛或10%福尔马林固定，然后蔗糖脱水，再切片。
这样虽然麻烦一些，可切片的形态会好很多。
切片可以晾干，而且在4摄氏度下可以保存1-2个月。
千万不能放-20度保存，否则会有严重的冰晶，切记。
冰冻切片最大的问题还是标本不能长期保存，要现取现做。
适合用于容易获取的动物标本。
chengjinxiang wrote:做冰冻切片的组织可以是直接放在液氮里直接冻存的组织吗？石蜡切片前的福尔马林固定的组织过大会怎么样，我们因为自己没有机器通常是把组织扔到甲醛里直到有一定量和有足够多标本才去包蜡块这样对组化结果有什么影响？做冰切的组织可以先在液氮中长期保存。
而且经过液氮冻存的组织冰切后的形态特别漂亮，一点儿冰晶都没有。
不过保存之前要先用OCT包埋。
切片之前要把冰切机预冷到工作温度（-20度以下）。
包埋块从液氮中一拿出来就要放进冰切机中，不能让包埋块融化，否则还是会出现严重的冰晶。
做HE染色的话，组织固定时间长一点儿没关系。
但如果做免疫组化的话，固定时间就不能太长。
脑病变组织快速石蜡切片和冷冻切片的比较
１２２ ．
速石 蜡切片 使用 Ｐ Ｔ ４０型病理样 品快 速超 声 Ｉ－ ４ ０
处 理仪 【 上海震 康 医疗器 材有 限公 司 ） 水浴锅 温 度 为 ６ ， ５～
７ ℃， Ｏ 组织 （ 个别组 织太小 ， 擦镜 纸包裹 ） １％福尔 马林 用 经 ０ 液 加ｒ 固定 ２ ｍｉ， ｒ Ｉ １ ～３ ｎ 去陈表面液 体 ； 用纯丙酮 ３ ｒ 脱水 ２ ０ｒ Ｉ １ — ３ ，ｍｎ次 （ 次 ３ｉ ／ 根据组织大小 、 类定 ） 组织脱 水后变 白且疏 种 ： 松， 浸蜡后将 已凝 固好 的蜡 块表面烫熔 ， 包埋组织 ， 待表面稍 凝将蜡块 平压于玻 璃表 面． 组织 包埋 面平整 ， 使 快速 挣冻 后 切片 （ ５ ）裱 片后用干燥 的滤 纸将 表面水 分吸干 ， ３～ ； 酒精 灯烘 烤 ｌ ～１ｓ快速 Ｈ Ｏ ５， Ｅ染色 ＝由 ３位病 理医师双盲 观察。
【 图分类号 ｌ Ｒ ４ 中 ４６８
【 文献标识码 】 Ｂ
【 文章编 号】０ ７ ｏ ６ ２ｔ １ｌ Ｏ ５ １０ 一ｓ９ （ｏ２ｏ — Ｏ４—０ ｒ １
３ 讨 论
快速病理切 片分为 持 陈切 片 和快速石 蜡切 片两 种。脑 组织快速进检标本 由于组织较小且 质地疏松 、 以制 成优质 难 的快 速病 理切片 。本文 就使 用超声 渡处理 仪对脑 组织 进行 快速石蜡切片并 和冷冻切片进行 比较 。
・
学 习班 通 知 ・
全军皮肤 病中心 、 空军 总医院与北京协 和医院皮肤科将 于 ２ Ｏ 年 ４月上 中旬在北 京联 台举 办为期 ２ 的皮肤病理 学 习 ０２ － 周
班（ 第二期 ）参加者授予医学继续教育学分 加 分。奉 次学习班 由北京协 和医 院王家 璧教授 和空军 总医院赵广 主任医师 主要 ．
石蜡切片和冷冻切片
石蜡切片战热冻切片——愚愚分出有收会系列之阳早格格创做正在构造真验中，构造切片战热冻切片是最罕睹的二种切片要收，二种劣缺面明隐，正在真验的应用上也大有分歧.而二个真验的相共面皆是应用免疫教基根源基本理——即抗本与抗体特同性分离的本理，通过化教反应使标记表记标帜抗体的隐色剂隐色去决定构造细胞内蛋黑量，对于其举止定位、定性及相对于定量的钻研.一、石蜡切片构造教惯例造片技能中最为广大应用的要收.石蜡切片出有但是用于瞅察仄常细胞构造的形态结构，也是病理教战法医教等教科用以钻研、瞅察及推断细胞构造的形态变更的主要要收，而且也已相称广大天用于其余许多教科范围的钻研中.1、牢固：将新陈构造切成小块，牢固于4%多散甲醛过夜.凝固构造中的物量身分，尽大概脆持其活体时的结构.共时能使构造硬化，有好处切片的举止.2、脱火：为了缩小构造资料的慢遽中断，应使用从矮浓度到下浓度递加的程序举止经70%、85%、95%曲至杂酒粗（无火乙醇），屡屡时间为1小时.牢固后的构造资料需与消留正在构造内的牢固液及其结晶重淀，可则会做用后期的染色效验.3、透明：时常使用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂.杂酒粗出有克出有及与石蜡相溶，还需用能与酒粗战石蜡相溶的溶剂，替换出构造内的酒粗.资料块正在透明剂浸渍历程称透明.4、浸蜡：先把构造资料块搁正在熔化的石蜡战二甲苯的等量混同液浸渍1小时.先后移进2个熔化的石蜡液中浸渍1小时安排.5、包埋：以少许热蜡液将其底部赶快揭附于包埋盒内上，而后置于速冻台，让石蜡牢固.6、切片：切片刀的钝利与可、蜡块硬度是可适合皆间接做用切片品量，可将蜡块至于热火中改变蜡块硬度.常常切片薄度为5微米，用毛笔沉托沉搁正在37度火浴中展片.7、揭片与烤片：将火浴中展片捞至玻片上铺正，而后将载玻片搁进37℃温箱中搞燥.8、切片脱蜡及火化：搞燥后的切片置于二甲苯中举止脱蜡，而后依次使用从下浓度到矮浓度递减的程序举止经杂酒粗、95%、85%、70%举止火化.9、染色：典范的苏木粗战伊黑：细胞核被苏木粗染成紫蓝色，普遍细胞量及非细胞身分被伊黑染成粉黑色.真验支配简朴.免疫组化：指戴隐色剂标记表记标帜的特同性抗体正在构造细胞本位通过抗本抗体反应战构造化教的呈色反应.二、冰冻切片：冰冻切片是一种正在矮温条件下使构造赶快热冻到一定的硬度，而后举止切片的一种要收.创造历程较石蜡切片快速、烦琐，果多应用于脚术中的赶快病理诊疗.一、与材：应尽大概快天采与新陈的资料，预防构造爆收死后变更.二、速冻：1、将构造块仄搁于硬塑瓶盖大概特造小盒内（曲径约2cm）.2、如构造块小可适量加OCT包埋剂浸出构造，而后将特造小盒慢慢仄搁进衰有液氮的小杯内.3、当盒底部交战液氮时即启初气化沸腾，此时小盒脆持本位切勿浸进液氮中，约莫10-20s构造即赶快冰结成块.4、正在造成冻块后，即可置进恒热箱切片机冰冻切片.5、若需要保存，应赶快以铝箔大概塑料薄膜启包，坐时置进-80℃冰箱贮存备用.三、牢固：1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻构造置于其上，4℃冰箱预热5-10min让OCT胶浸透构造.2、与下构造置于锡箔大概者玻片上，样品托速冻.3、构造置于样品托上，其上再加一层OCT胶，以真足覆盖为宜，速冻架（PE）上30min.四，切片：1、恒温冰冻切片机为较理念的冰冻切片机，其基础结构是将切片机置于矮温稀关室内，故切片时出有受中界温度战环境做用，可连绝切薄片至5-10μm.2、切片时，矮温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过矮构造易破碎，抗卷板的位子及角度要适合，载玻片附揭构造切片，切勿上下移动.3、切佳室温搁置30min后，进4℃丙酮牢固5-10min，烘箱搞燥20min.PBS洗5min×3.4、举止抗本热建复，微波热建复也可，室温自然热却.可用3%H2O2孵育5-10min，与消内源性过氧化物酶的活性.五、免疫荧光染色：1、冰冻切片室温晾搞15min，可用含10%仄常山羊血浑的PBS室温启关切片1小时（此步可出有洗）.2、滴加适合比率稀释的一抗大概一抗处事液（抗体的量视构造大小而定，准则是不妨匀称覆盖构造里，且包管所有历程中出有会使构造搞涸）.3、将切片搁正在加了PBS的免疫组化干盒，室温孵育2小时大概4℃过夜.4、第二天先将干盒搁到37℃回温1h，而后吸与片上的一抗举止回支，将切片拔出到小染缸PBS浑洗.5、滴加用PBS稀释佳的二抗（躲光）置于分子杂接箱中37℃孵育1小时.回支二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次.6、滴加DAPI处事液染核，室温10-20min（处事浓度0.1%染色15min）.7、回支DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减启片剂大概中性树胶，用处理搞洁的盖玻片启片，即可到荧光隐微镜大概者共散焦隐微镜下瞅察拍照.8、搞佳的切片搁正在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周安排.对于比：。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
*作者：座殿角*
作品编号48877446331144215458
创作日期：2020年12月20日
实用文库汇编之石蜡切片和冷冻切片——傻傻分不清楚系列
在组织实验中，组织切片和冷冻切片是最常见的两种切片方法，两种优缺点明显，在实验的应用上也大有不同。
而两个实验的相同点都是应用免疫学基本原理——即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内蛋白质，对其进行定位、定性及相对定量的研究。
一、石蜡切片
组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
1、固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物
质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2、脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响
后期的染色效果。
3、透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
4、浸蜡：
先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5、包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6、切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为5微米，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7、贴片与烤片：将水浴中展片捞至玻片上铺正，然后将载玻片放入37℃温箱中干燥。
8、切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9、染色：
经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
二、冰冻切片：
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。
制作过程较石蜡切片快捷、简便，因多应用于手术中的快速病理诊断。
一、取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
二、速冻：
1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
三、固定：
1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
四，切片：
1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。
2、切片时，低温室内温度以-15℃~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。
PBS洗5min×3。
4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。
可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。
五、免疫荧光染色：
1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。
2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。
3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。
5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。
回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。
6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。
7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。
8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。
对比：
作者：座殿角
作品编号48877446331144215458 创作日期：2020年12月20日。