绿色荧光蛋白在转基因研究中的应用_张雨丽

需要复杂的样品固定和制备过程 、昂贵的底物 ;有些 需要漫长的抗性筛选 , 对胚胎有一定的毒害作用 ;大 部分还需要特殊的检测手段 , 给转基因研究工作增 加了难度 , 均 不够理 想 。 而 将 GFP应用 于标 记基 因 , 可以避免以上缺陷 , 能够有效 、快捷的对转基因 个体进行筛选 , 大大提高了转基因工作效率 。
转基因的方法很多 , 适用于不同生物的转基因 方法也不同 。在做转基因之前 , 研究者必须先摸索 出最有效的方法 , 以提高转基因的成功率 。 目的基
因构建到表达载体上后的表达情况通常是不清楚的 (有许多表达条件需要摸索 ), 一旦检测不到基因的 表达 , 就很难判断是转基因方法不恰当 , 还是基因表 达本身出现问题 。所以如果直接用目的基因进行有 效转基因方法的探索 , 将给转基因工作带来很多困 难 。 GFP的表达无种属特异性 、表达调控及翻译后 修饰过程简单易控制 、通常表达量也很高 , 将目的基 因替换为 GFP基因进行不同生物转基因最优方法 的探索 , 将会缩小研究难度 。
黄国存等 [ 12] 分别用花粉管通道法和农杆菌介
导法将携带有 GFP基因的外源基因导入棉花 , 发现 用手持紫外灯结合显微镜检技术能够快速地对转化
子进行活体筛选鉴定 , 明显比 GUS检测方法优越 。 程在全等 [ 13] 用基因枪法将带有绿色荧光蛋白基因
的质粒 pJPM5和 pSBG700分别转入水稻 TNG67愈 伤组织 , 在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基 因的表达 , 绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋 白信号比植株的自发荧光强得多 , 且不会受自发荧 光的太大影响 。因此 , 绿色荧光蛋白基因可以作为 水稻 (甚至小麦 、玉米 )转基因研究中的报 告基因 。 李华等[ 14] 将 GFP表达质粒导入 BHK、DK、RK等真 核细胞 , 建立真核细胞转基因指示系统 , 结果表明 , GFP的表达对胚胎无损伤 , 又经济简便 , 可避 免 β 半乳糖苷酶等报告基因的不足 , 是提高基因转移与 筛选效率的理想途径 。 Vain等 [ 15] 第一次对抗生素 筛选与 GFP筛选进行了直接比较 , 研究表明 GFP能 大大提高转化的工作效率 , 减少了转基因植株分子 检测步骤和工作量 。 2.2 用于寻找转基因所需的启动子 、增强子等调控
Abstract: Thegreenfluorescentprotein(GFP)isakindofluminescenceprotein, whichcancatalyzeitselfintochromophoresand emitgreenfluorescentwhenexposedtobluelightorultravoiletlight.GFPwascalledbigdipperofmodernbiology, whichwasused widelyinmanyfieldsofbiology.GFPpossessesthetripleadvantageofstablefluorescence, includingeasyinspection, simpleexpression andregulation, safetoorganisms, thus, ithasbeenusedwidelyinmanyaspectsoftransgenicresearch.Thisarticlebrieflyintroducedthe characteristicsandprogressofGFPapplicationintransgenicresearch.
收稿日期 :2010-05-04 作者简介 :张雨丽 , 女 , 硕士研究生 , 助理农艺师 , 研究方向 :家蚕分子育种 ;E-mail:ZYL8324@ 126.com
2010年第 9期
张雨丽等 :绿色荧光蛋白在转基因研究中的应用
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突变体 , 且增强了荧光强度 , 适合在不同物种中专性 表达 。 Tsien[ 6, 7] 发展了颜色迥异的 GFP突变体 , 包 括蓝色荧光蛋白 BFP(bluefluorescentprotein)、青色 荧光蛋白 CFP(cyanfluorescentprotein)和黄色荧光 蛋白 YFP(yellowfluorescentprotein)。 随着研究深 入 , 抗酸 、抗漂白 、亮度高 (消光系数与量子产率乘 积 )、成熟快及单体结构的 GFP变体将越来越多 , 激 发和发射光谱范围也将不断拓宽 , 对该蛋白的检测 将越来越容易 。 1.2 表达调控简单 , 构建载体方便
1.1 GFP荧光稳定 , 易于检测 GFP的荧光较稳定 , 抗光漂白能力比荧光素强 ,
能耐受较长时间的光照 。 GFP在 pH7 -12 范围内 都能正常发光 ;对高温 (70℃)、碱性 、除垢剂 、盐 、有 机溶剂和大多数普通酶等都有较强抗性 [ 5] 。
GFP中的发色团是由其一级结构中的一段三肽 自然形成 , 该发色团的形成只需要氧气 , 不依赖于酶 或者其它辅助因子 , 仅以紫外光或蓝光激发 , 即可发 出绿色荧光 。 用肉眼 、荧光显微镜均可以观察到 , 且 灵敏度高 , 还 可进行表达量的 半定量或定量检 测 。 另外 , GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的
Rolling等[ 18] 将腺相关病毒载体 (AAV)与 GFP 构建成 rAAV-GFP重组质粒 , 经视网膜下腔注射到 大鼠眼内 , 在整个试验过程 (4 个月 )中均能观察到 GFP的表达信号 , 说明 AAV能够有效地转染视网膜 色素上皮细胞 (RPE)。 Bennett等 [ 19] 将携带有 GFP 的 cDNA重组腺相关病毒 (rAAV)经视网膜下腔注 射到成年的免疫活性小鼠眼内 , 用激光扫描眼底镜 进行观察 , 试验结果表明 , rAAV能有效稳定地介导 视网膜基因转移而无明显的毒性及免疫反应 。 杨国 顺等[ 20] 利用 GFP基因 优化 了辣 椒的 遗传转 化体 系 。 Hu等[ 21] 用电激 法和 PEG法同 时转化玉米和 拟南芥菜 (Arabidopsis)原生质 体 , GFP在 玉米原生 质体中表达 , 且 PEG介导比电激法转化效率高 ;而 拟南芥菜原生质体中未观察到 GFP表达 。 但 Sheen 等 [ 22] 利用基因枪 (Microprojectilebombardment)轰击 拟南芥菜叶片和根组织 , 观察到 GFP的表达 。 宋军 等 [ 23] 以绿色荧光蛋白基因为目标基因 , 用脂质体转 染猪胎儿成纤维细胞 , 并以绿色荧光蛋白基因转染 后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体 , 以体外
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
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启动子连接 , GFP在玉米原生质体中的表达效率比 对照质粒 (只有 35S启动子 )提高近 15倍 , 因为 5′ UTR片段中含转录增强子 [ 16] 。将蓝氏贾第虫谷氨 酸脱氢酶 (GDH)启动子和 GFP构成融合基因 , 转化 贾第虫 , 可以观到绿色荧光 , 从启动子的 5′-末端进 行逐步缺失 , 制备一系列突变体并构成融合基因 , 转 化蓝氏贾第虫 , 能确定出 GDH启动子核心序列[ 17] 。 2.3 用于探索不同物种的有效转基因方法
GFP中的发光团由一些常见的非特异氨基酸构 建而成 , 它的翻译后修饰过 程不需要原有水母 (A. victoria)细胞中任何其它成分或共因子 , 在细胞内呈 自主表达 。 利用 GFP发光时 , 只需要操纵细胞合成 GFP蛋白 , 无需复杂的翻译后加工过程 , GFP就会自 动折叠催化并开始发光 , 在微生物 、植物 、动物中都 获得了成功的表达 。 由于 GFP分子量较小 , 只含有 238个氨基酸 , 编码 GFP的基因序列也较 短 , 约为 2.6 kb[ 8] , 所以它可以很方便地同其它序列一起构 建多种载体 , 而不至于使质粒过大而影响转化效率 。 1.3 生物安全性好
Keywords: Greenfluorescentprotein(GFP) Transgenicresearch Applications
1962年 Shimomura等 [ 1, 2] 最早从水母中分离并 描述 了 绿 色 荧 光 蛋 白 (greenfluorescentprotein, GFP), 该 蛋 白 在 紫 外 光 或 蓝 光 激 发 下 发 荧 光 。 Chalfie[ 3] 首次发现 GFP在无任何底物和辅助因子
元件
基因的表达调控研究与转基因研究相辅相成 , 用转基因方法可研究基因的表达调控 , 而基因的表 达调控研究可更好地指导并应用于转基因研究 。 启 动子 、增强子等是基因表达调控的重要元件 , 也是转 基因所需的组件 。 用不同的启动子与 GFP基因相 连 , 构成不同的表达质粒 , 用于转化合适的细胞 , 通 过观察细胞的荧光强度 , 就可以比较判断启动子的 强弱 , 找出适 合用于转基因的启动子 。 Clontech公 司构建了一种叫启动子报告载体 (Promoterreporter vector), 即没有启动子的 GFP质粒 , 专门用来测试 各种启动子对 GFP表达的效率 , 以及某些增强子对 GFP表达的调控效果 。 用玉米 C4PPDK基因 5′端 的非翻译片段 (5′UTR)与 花椰菜花叶病 毒的 35S
关键词 : 绿色荧光蛋白 (GFP) 转基 因研究 应用
ApplicationsofGreenFluorescentProteininTransgenicResearch
ZhangYuli ZhangGuizheng SuHongmei MengYiying BiLihui
(GuangxiResearchAcademyofSericulturalScience, Nanning530007)
情况下 , 也能在活细胞内发荧光 , 可用于标记细胞和 蛋白质 。 Tsien[ 4] 则率先提出了 GFP发光的化学机
制 , 并发展了不同颜色的 GFP突变体 。瑞典皇家科 学院把 2008年 的诺贝尔化学奖授予了以 上 3人 。 科学研究人员利用 GFP能够在分子水平方便地追 踪许多生命活动的发生与发展过程 。 例如 , 能看到 大脑神经细胞的发育过程和癌细胞的传播方式等 。 GFP直接将生物学研究由以前的 “死物学 ”变成了 “活物学 ”, 大大推动了生物学的发展 。目前 GFP基
·综 述与 专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
20 10 年第 9 期
绿色荧光蛋白在转基因研究中的应用
张雨丽 张桂征 苏红梅 蒙艺英 闭立辉
(广西蚕业科学研究院 , 南宁 530007)
摘 要 : 绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein, GFP)是一 种能够 自身催 化形成 生色团 并在蓝 光或紫外 光激发 下发出 绿色荧光的蛋白 。 有现代生物学北斗星 之美誉的它 , 在生 物学的 很多领 域都有 广泛应用 。 GFP具有 荧光稳 定 、易于检测 、表 达调控简单 、生物安全性好等优点 , 在转 基因研究中的各个方面均应用颇多 。 就 GFP在转基因研究中的 应用特点及 应用进展 做一综述 。
从目前的研究结果来看 , GFP对活细胞基本无 毒害 , 转化后细胞可连续传代 , 对受体的生长发育及 功能等均无明显影响 [ 9 -11] 。
2 GFP在转基因研究中的应用进展
2.1 用于筛选转基因成功个体 外源目的基因转入宿主后 , 能稳定整合的频率
低 , 通常是将携带有目的基因的载体转到若干个宿 主中 , 再从该若干个细胞 (或其它 )中筛选出成功转 化并表达目的基因的个体 。 因此 , 如何准确和有效 地区分转化与非转化细胞 、筛选转化成功的个体是 转基因研究中重要的一步 。 在这一步中 , 科研工作 者通常是在目的基因上游加一个筛选标记基因 , 利 用筛选标记基因在移植前进行阳性筛选 , 仅把阳性 细胞移入受体 , 则可大大提高转基因动植物的成功 率 , 减少转基因个体筛选鉴定的工作量 。 目前常采 用的筛选标记基因主要有 :氯霉素乙酰转移酶基因 (CAT), 葡 萄 糖苷 酶 基 因 (GUS), 荧光 素 酶 基因 (Luc), 新霉素磷酸转移酶基因 (NPT), 潮霉素磷酸 转移酶基因 (HPT)等 。利用这些标记基因时 , 有些
因已经在生物学的诸多研究领域得到应用 , 在转基 因研究中的应用也颇多 。 GF百度文库基因应用到转基因研 究中具有检测简 便 、荧光 稳定 、生物 安全性好等优
点 , 所以逐步成为转基因研究的良好材料和工具 。
1 GFP在转基因研究中的应用特点
目前转基 因研 究与应 用 的发 展十 分迅 速 , 将 GFP基因应用到转基因研究中 , 具有其它基因所无 法比拟的以下诸多优点 。