生物学实验 质粒DNA的提取

实验8 质粒DNA的提取（碱裂解法）

一、实验目的

了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。

二、实验原理

碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。碱性（pH 12.0~12.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。

三、仪器设备

微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1 000 μL），tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。

四、实验试剂

（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L Tris·HCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ℃，0.105 Mpa）20 min。4 ℃贮存。

（2）溶液Ⅱ（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。

（3）溶液Ⅲ（pH 4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H2O 28.5 mL。

（4）RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。

五、实验方法

（1）分装3 mL LB液体培养基和3 μL氨苄青霉素（50 mg/mL）于15 mL玻璃试管中。（2）用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入玻璃管内，置37 ℃恒温摇床中以200转/min培养，至OD600=2.0。

（3）取菌液1.0 mL于1.5 mL的Eppendorf 管中，将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速3 500 g，离心5 min，收集细菌。弃上清，倒置于吸水纸上，沥干残液。

（4）每离心管中加入冰上预冷的溶液Ⅰ200 µL，置振荡器上剧烈震荡，悬浮菌体。

（5）加入新配制的溶液Ⅱ400 µL，翻转10次。冰上放置。

（6）冰浴3 min内迅速加入300 µL溶液Ⅲ，温和翻转10次，冰浴10 min。

（7）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速12 000 g，离心5 min。取上清液于新管中，同时加入Rnase（10 mg/mL）10 µL，混匀，37 ℃保温2 hr。

（8）加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），置摇床上震荡5 min，将离心管放入冷冻离心机，调温至4℃，转速12000 g，离心10min。

（9）取上清液于新的离心管内，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），摇床震荡5 min。（10）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速12 000 g，离心10 min。取上清，加入等体积异丙醇，迅速翻转5次，冰上放置10 min。

（11）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速12 000 g，离心10 min。弃上清，倒置于吸水纸上。加入500 μL 70 %的乙醇轻振，洗涤沉淀。

（12）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速12 000 g，离心10 min。弃上清，室温干燥沉淀30 min。

（13）加入20 μL无菌水溶解DNA，电泳检测。

六、实验结果

质粒DNA电泳图

七、提取质粒DNA过程中应该注意的问题

（1）细菌细胞的裂解是分离质粒DNA的关键步骤。通常可以加入溶菌酶或SDS促使大肠杆菌细胞裂解。如果细菌细胞没有完全裂解，会明显降低质粒DNA的回收率。理想的状况是每一个细菌细胞都能够被充分破裂使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。

（2）质粒提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作过程中手法要温和，尽可能避免脱氧核糖核酸酶（DNase）对质粒DNA的降解和破坏。

（3）电泳时上样孔中如果有白色物质，是由于蛋白质没有去除干净。

（4）质粒共有三种构型：

共价闭合环形DNA（cccDNA）：质粒的两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；开环DNA（ocDNA）：质粒的两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一或数个缺口，即OC构型；线性分子（l DNA）：质粒DNA经过适当的核酸限制内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性DNA分子，通称L 构型。相同分子质量质粒的三种构型在正常情况下电泳时，迁移速率分别是：超螺旋

DNA比线性的DNA迁移率大，线性DNA比开环DNA迁移率大。

八、作业

（1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验用品及药品、实验步骤等，要详细阐述质粒提取的基本原理。

（2）提取质粒DNA过程中应该注意的问题是什么？

（3）质粒DNA的三种构型及在正常电泳条件下的迁移情况如何？