Sanger双脱氧链终止法

假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个 碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生 一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序 列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP 掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延 伸, 产生GATCCGAT. 1 产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA.
所需模板及其获得方法:
单链DNA可以由双链DNA完全变性而得到. 其方法,简单的来说, 将反应体系加热至95℃即可得到.
dATP与ddATP的区别:
dATP为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸,生物用dNTP来 合成DNA . ddATP为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸,核糖2号3号 C上羟基的O被脱去,由于它掺入DNA后DNA的合成 就终止了,所以ddNTP是用来测序的.
DNA聚合酶的特点:
其耐热性极强, 在 95 ℃ 40 min, 仍具有 很强的聚合活性; 利用重组酶在常规PCR 条件下, 成功扩增了5.3 kb的拟南芥Timeless 基因片段.
关于引物:
可以购买通用 引物或实验室 合成15bp ～ 26bp长度的引 物,通常以 2μg/ml的浓度 贮存于-20℃ 备用.
Sanger双脱氧链Fra Baidu bibliotek止法 双脱氧链终止法
——DNA测序的基本方法
基本原理:
将2' ,3' –双脱氧 核苷酸(ddNTP) 参入到新合成的DNA 链中,由于参入的 ddNTP缺乏3' –羟基, 因此不能与下一位 核苷酸反应形成磷 酸二酯键,DNA合成 反应将中止.
核苷酸的连接方式:磷酸二酯键
通常DNA的复制需要:DNA聚合酶,纯单链DNA模板, 带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物,4种dNTP (dATP,dGTP,dTTP和dCTP), ddNTP .
将得到如下结果:
2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC 3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT
制得的四组混合物全 部平行地点加在变性 聚丙烯酸受凝胶电泳 板上进行电泳,每组 制品中的各个组分将 按其链长的不同得到 分离,从而制得相应 的放射性自显影图谱. 从所得图谱即可直接 读得DNA的碱基序列.
Sanger双脱氧链终止法的具体操作: 双脱氧链终止法的具体操作: 双脱氧链终止法的具体操作
测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分 别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸 (称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP), 然后进行 聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代 替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA 链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止 了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反 应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就 可以读出序列了.
即可得到测序结果:为GATCCGAT
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