杆状病毒及其持续性感染细胞的研究现状及展望

杆状病毒及其持续性感染细胞的研究现状及展望黄磊（贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001）摘要：杆状病毒（Baculovirus）是一类专一性寄生于节肢动物，且具囊膜包被的双链闭环DNA病毒，是一种具有潜力的生物杀虫剂，也是生态系统的一个组成部分，是调节昆虫种群密度大小的重要病原因子。

了解杆状病毒持续性感染细胞的研究现状，对后续研究病毒-宿主关系、杆状病毒的持续感染及激活的机制、利用杆状病毒作为真核表达载体、开发杆状病毒应用于农林业病虫害防治、控制昆虫种群密度等方面具有重要意义。

关键词：杆状病毒；病毒的持续性感染；现状及展望Baculovirus And Baculovirus Persistent Infection Cells Status AndProspectsHuang Lei(School of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China) Abstract: Baculovirus are a class of specific parasitic arthropods, and capsular bag closed by a double-stranded DNA virus. It is a potential of the bio-pesticides, is an integral part of the ecosystem, also the important etiologic agent to regulation of insect population density size. Understanding Baculovirus persistent infected cells research status, on the follow-up study the relationship of virus-host ,the baculovirus persistent infection and activation mechanisms, use baculovirus as a eukaryotic expression vector, and develop baculovirus to use in pest control of agroforestry, as well as control insect population density and other aspects of great significance. Key words: Baculovirus;Baculovirus persistent infection; research status and prospects 杆状病毒专一性寄生于节肢动物，对人类和环境安全，且昆虫一般不产生抗性，因而在害虫治理中受到极大关注[1]。

比如，甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus, SeMNPV）是Steinhaus于1949 年,首先在美国加利福尼亚州从罹病甜菜夜蛾幼虫中分离得到，寄主专一，且毒力较高[2],因而成为了一种具有潜力的生物杀虫剂。

杆状病毒也是生态系统的一个组成部分，是调节昆虫种群密度大小的重要病原因子[3]。

杆状病毒持续性感染细胞的研究，对了解病毒-宿主关系、杆状病毒的持续感染及激活的机制、利用杆状病毒作为真核表达载体、开发杆状病毒应用于农林业病虫害防治、控制昆虫种群密度等方面具有重要意义。

一、杆状病毒的生物学特征1.杆状病毒定义及分类杆状病毒是一类具囊膜包被的双链闭环DNA，并寄生于节肢动物的专一性病原微生物，其宿主主要是鳞翅目(Lepidoptera)、膜翅目(Hymenoptera )和双翅目(Diptera)的昆虫。

目前已从超过800种昆虫体内分离鉴定出600多种杆状病毒[4-5]。

杆状病毒隶属于杆状病毒科（Bacul oviridae），根据国际病毒分类委员会（ICTV）1995年第6次报告，杆状病毒科包括两个属，即核多角体病毒属（Nucleopolyhedrovirus, NPV）和颗粒体病毒属（Granulovirus, GV）[6]。

近年来，杆状病毒的基因组序列的大量产生极大地拓展了对它多样性和进化的了解，病毒亲缘关系产生了明显的规律，那就是病毒的谱系图与它们所感染的宿主是关联的。

ICTV 在2012年第9次报告，将杆状病毒科分为四个属：Alphabaculovirus(鳞翅目特异NPVs)、Beta baculovirus(鳞翅目特异GVs)、Gammabaculovirus(膜翅目特异NPVs)和Deltabaculovirus(双翅目特异NPVs)[7-9]。

2.杆状病毒生活史及传播途径杆状病毒在其生活周期中产生两种不同类型的病毒粒子：芽生型病毒粒子（budded vir us, BV）和包埋型病毒粒子（occlusionderived virus, ODV）。

二者核衣壳组成相同，但形态不同，囊膜蛋白和脂质的组成也不同[10]。

杆状病毒的病毒粒子呈杆状，包埋在多角体蛋白组成的包涵体OB中。

OB是杆状病毒的一个与众不同的结构，直径500～2000nm，可在光学显微镜下观察到[11]。

OB在自然环境中非常稳定，ODV包裹在具保护性的OB中是杆状病毒能在环境中持续存在的一个重要因素。

该病毒传播途径有两种，通常认为昆虫吞食OB在虫体间水平传播是其主要途径；杆状病毒也能通过卵表（卵的表面污染）和经卵内部从成虫到幼虫的垂直传播途径，导致下一世代的宿主出现明显症状和无病症的病毒感染。

垂直传播可补充水平传播，也为日后水平传播提供疾病病原[12]。

3.杆状病毒分子生物学杆状病毒具闭合环状超螺旋结构的双链DNA基因组，大小80～180kbp,编码约90～18 0个开放读码框（Open Reading Frame, ORF）[13]。

DNA复制为滚环复制，在被感染的细胞中，某些反式因子和顺式作用元件可形成复制复合体[14]。

目前，58种杆状病毒的基因组序列已被测定，包括41种Alphabaculovirus、13种Betabaculovirus、3种Gammabaculoviru s和1种Deltabaculovirus[15]。

杆状病毒基因组之间存在较大的差异，G+C的百分比含量为33～58%，全长大于50个氨基酸的ORFs数目为89～181个[16]。

基因组中编码蛋白质的序列约占全长的90%，这些基因排列紧凑，极少重叠，均匀分布于基因组两条链上。

两条链具相同的编码能力，基因顺时针方向与逆时针方向进行的转录各占50%。

功能相关的基因并未以成簇的方式出现，而是分散在整个基因组中。

在已完成全基因组测序的所有杆状病毒中，有31个基因是全部杆状病毒所共有的，他们组成杆状病毒的核心基因[17]。

大部分核心基因的功能已经明确，大致分为复制相关基因、转录相关基因、结构蛋白基因、口服感染因子基因、辅助基因和未知功能基因[18]。

杆状病毒基因的转录表达具时序性，按照表达时间先后分为早期基因（early gene）和晚期基因（late gene）两大类[19]。

早期基因又可分极早期基因（immediate early gene）和滞早期基因（delayed early gene）;晚期基因的表达发生在DNA复制开始之后，可分为晚期基因（late gene）和极晚期基因（very late gene）。

二、病毒的持续性感染1.病毒持续性感染的定义病毒给我们的印象是大范围死亡和突发流行病，但在正常环境中，包括与人类疾病相关的病毒在其宿主中的潜伏/持续感染是一个普遍的现象，潜伏/持续感染其宿主是囊膜病毒生存的一个策略，如在人类宿主中潜伏几十年的疱疹病毒（herpes virus）[20]、冠状病毒（coronavirus）[21]等。

潜伏/持续感染（latent infection）是广义持续感染的一种类型，是可转化、非增殖性的感染，病毒基因组在宿主中保留，但不引起明显感染症状；除非激活期间，通常并不产生感染性的病毒[22]。

广义的持续感染（pesistent infection）泛指病毒在宿主内存活时间长，可达数月、数年甚至终生，伴随或不伴随病症发生的情况[23]。

2. 杆状病毒持续感染的研究现状昆虫杆状病毒持续感染的现象在100多年前就已观察到[24]。

1997年发现在实验室维持的一个甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae）株系中含有甘蓝夜蛾核多角体病毒（Mamestra brassicae multiple nucleopolyhedrovirus, MbMNPV）基因序列，通过间接证据表明MbM NPV低水平持续感染于该甘蓝夜蛾株系中[25]。

对英国不同地区的甘蓝夜蛾检测表明Mb MNPV持续感染于大多数种群中，携带MbMNPV的甘蓝夜蛾比例为50%～100%，表明杆状病毒持续感染在自然昆虫宿主种群中广泛存在。

杆状病毒潜伏/持续感染可能有两方面的好处。

一方面使得病毒在不利环境下，如宿主密度低时在昆虫体内存活但不影响昆虫增殖和分布等主要功能；另一方面潜伏/持续感染可转化为增殖裂解感染导致昆虫死亡[26]。

在某些因素如摄食异源病毒、低温、高虫口密度和食物的改变等刺激下，杆状病毒的潜伏/持续感染可转化为裂解增殖型感染[27-28]，引起昆虫杆状病毒流行病的发生。

另外，杆状病毒生活周期中的垂直传播可能是杆状病毒持续感染昆虫的一个间接现象[29]。

近年来的研究表明杆状病毒在自然昆虫种群中的持续感染比预期的更为普遍[30],但在昆虫体内设计实验以了解杆状病毒持续性感染的产生、维持以及激活的分子机制受到限制[31],所以在细胞水平建立病毒﹣细胞模型成为探索杆状病毒持续性感染分子机理的关键，由于杆状病毒是裂解性的病毒，感染宿主后导致细胞解体死亡，因而较难构建一个稳定的持续感染细胞系，目前只有少量相关模型的报道。

Mclntosh和Ignoffo(1981)以及Crawford和Sheehan(1983)分别利用空斑纯化的草地贪夜蛾核多角体病毒（Spotoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus, SfNPV）在草地贪夜蛾（S.frugiperda）细胞中建立了持续感染；苜蓿丫纹核多角体病毒（Autographa californica m ultiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）抗凋亡基因p35缺失或突变株感染草地贪夜蛾细胞导致细胞大量凋亡，但随后也可建立持续感染[32];我国复旦大学学者将中国棉铃虫核多角体病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus, HearNPV）感染棉铃虫(H.armige ra)HA细胞，建立了一株持续感染细胞株[33]，y也有人将甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodopt era exigua multiple nucleopolyhedrovirus, SeMNPV）感染甜菜夜蛾(Spodoptera exigua）细胞系Se301，建立了SeMNPV持续感染的P8–Se301细胞系。