大肠杆菌基因工程菌株的构建及发酵试验

图 2 OD600 值随时间的变化趋势
图 3 pH 值随时间的变化趋势
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2012 生工大实验
图 3 pO2 值随时间的变化趋势
3.4 GFP 离子交换层析分离
在洗脱过程中先用 Buffer A 洗，没有荧光洗脱。Buffer B 梯度洗脱至 17 管的开始出峰但未见荧光。至 20 管时可见荧光，第 21 管时荧光最强。
水+感受态大肠杆菌 LB 平板培养基 LB+Amp 平板培养基 LB+Amp+ara 平板培养基 5000 个 99 个 776 个
pGLO+感受态大肠杆菌 5000 个 5000 个 1616 个
注；其中 LB 平板培养基菌落过于密集无法计数按 5000 计，pGLO+感受态大肠杆菌接种于 LB+Amp 平板培养基涂布不均菌落
280/260 7 0.15 0.15 0.15 0.68 0.68 0.68 0.86 0.93 0.99 0.25 0.25 0.40 2 0.038 0.038 0.03 0.48 0.48 0.40 1.22 1.45 1.55 0.03 0.03 0.03
表 5 对照标准比值
0.15M 甲酸 0.189 0.226 0.081 0.032 0.836 0.358 0.142 840
0.01M 甲酸+0.05M 甲酸钠 0.134 0.164 0.059 0.016 0.817 0.360 0.098 900
0.1M 甲酸+0.1M 甲酸钠 0.172 0.174 0.098 0.034 0.989 0.563 0.195 720
pH 6.22 6.21 6.32 6.38 6.20 5.80 5.55
pH(试纸测)
pO2 16.70 120.00 120.00 120.00 82.20 104.70 120.00
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6.3 6.0
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9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
忽略不计。
转化子总数 感受态细胞总数
= 0.408%
3.2 摇瓶发酵条件试验
从正交试验结果中，我们可以得到本次实验的直观最佳条件，但这不一定是最佳理论值。我们可以根 据实验的最佳条件和理论最佳条件进行比较，在下一步试验中可以在这些水平范围内，进行改变和加密水 平以求得更荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP) 是源于发光水母(Aequorea victoria )的一种蛋白质, 其单 体分子量为 27k Da， 由 238 个氨基酸构成,是一个生物发光系统,这种蛋白质在体外经适当波长的光激发可发 出绿光, 所发出的绿光用普通荧光显微镜或荧光激活细胞分拣器(FACS) 均可检测到。GFP 作为动、植物以及 微生物基因工程研究上的一种广泛应用的选择标记具有检测灵敏度高, 操作简便, 对机体毒副作用小，不需 要添加任何底物或辅助因子，而且检测 GFP 无损于细胞或胚胎的完整性及活力等优点。 本实验拟利用重组 DNA 技术，构建转入外源 GFP 基因的重组大肠杆菌，并对基因工程菌培养条件进行 优化，在小型机械搅拌生物反应器进行发酵培养，并表达 GFP。 核苷酸的分离纯化采用离子交换层析法。离子交换作用一般指在固相和液相之间发生的可逆的离子交 换反应，它可用于分离各种可解离的物质。通常离子交换剂是在一种高分子的不溶性母体上引入若干大量 功能基团。这样人工合成的离子交换剂具有各种各样的性能。
转化子数 转化子总数 1840.44 转化频率 ( )＝ = = 920222.22 0.002 每 mg 质粒 DNA 质粒 DNA 加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组 2 菌落数 × 稀释倍数 × 菌液总体积 涂板菌液体积 = 5000 × 1 × 902 = 451000 10
感受态细胞转化效率＝
100.00 120.00 120.00 120.00 103.00 111.20 112.19 117.70 120.00 118.00 117.40
注：第 1 组数据为工程菌未接种时发酵罐培养基状况，2 组数据为接入工程菌后培养基的状况。两组测定间隔时间较短可以
发酵罐内培养基状态各种参数随时间变化趋势如下：
将不同 4 钟溶液洗脱液分别合并，并测 OD260、OD250、OD280、OD290 结果如下：
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2012 生工大实验 表 4 各洗脱液对不同波长光线吸收及比值
0.02M 甲酸 OD250 OD260 OD280 OD290 OD250/OD260 OD280/OD260 OD290/OD260 体积/mL
0.4 0.5 0.4 0.5 0.3 0.5 0.3 0.4
0.029 0.875 0.694 0.848 0.999 0.849 0.803 1.028
注：菌落呈现直径乳白色、0.5cm 左右大小、表面湿润、中心突起的形态。第 2 组数据弃除。
取第 1、4、6、8、9 按 OD600 值从小到大重新编号为 1、2、3、4、5，每组选 25mL 培养基离心弃去上清液， 烘干称重。
Construction and Fermentation of GFP Genetically Engineered E. coli and Separation of GFP and Single Nucleotide by Ion Exchange Chromatography
Abstract: Plasmid pGLO can express green fluorescent protein in E. coli DH5α when induced by L-arabinose. Fermentation in 5L fermenter got many biomasses. The separation of fragmented biomass by ion exchange chromatography got pure green fluorescent protein. The separation of mixed single nucleotide by ion exchange chromatography got four kind of pure single nucleotide. Key words: green fluorescent protein; fermenter; ion exchange chromatography; single nucleotide
2012 生工大实验
GFP 基因工程大肠杆菌的构建与发酵及 GFP 与单核苷酸离子交换层 析研究
摘要： 含有 pGLO 质粒的基因工程菌株 DH5α，在 L-阿拉伯糖诱导后，表达绿色荧光蛋白。经 5L 发酵罐培养获得大量菌体。破碎后细菌溶液经离子层析分离得到较纯的绿色荧光蛋白。利 用离子交换树脂分离酵母菌制备的单核苷酸得到 4 种单核苷酸。 关键词：绿色荧光蛋白，发酵罐，离子交换层析，单核苷酸
1.493 1.663 1.735 1.81 1.871 1.924 1.962 1.996 2.034 2.023 2.051
5.81 6.01 6.22 6.43 6.61 6.79 6.90 7.00 7.07 7.16 7.27
6.0 6.0 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 7.0 7.0 7.0 7.2
异构体 2' 3' 5' 2' 3' 5' 2' 3' 5' 2' 3' 5' 2 0.85 0.85 0.85 0.90 0.90 1.22 0.48 3.46 0.46 0.79 0.74 0.74
250/260 7 0.80 0.80 0.80 1.15 1.15 1.15 0.86 0.84 0.84 0.85 0.83 0.73 2 0.23 0.23 0.22 0.68 0.68 0.68 1.83 2.00 2.10 0.30 0.33 0.38
部分密集按 5000 计，接种于 LB+Amp+ara 平板培养基均采用 1/4 平板计数法
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此表 1 中的菌落数可计算出转化子总数和转化频 率 转化子总数＝菌落数 × 稀释倍数 × 转化反应原液总体积 涂板菌液体积 = 1616 × 1 × 902 = 1840.44 792
单核苷酸离子交换层析： 离子交换树脂上样后，先后用 0.02M 甲酸、0.15M 甲酸、0.01M 甲酸+0.05M 甲酸钠、0.1M 甲酸+0.1M 甲酸钠洗脱。结果如下：
图 5 LP Data View 软件软件导出图 图上曲线分别表示 AU 值与电导率
图 6 洗脱液 OD260 变化趋势 从左到右分别为 0.02M 甲酸、0.15M 甲酸、0.01M 甲酸+0.05M 甲酸钠、0.1M 甲酸+0.1M 甲酸钠洗脱峰
0.074 0.144 0.254 0.178 0.514 1.764 1.236 650
核苷酸 腺嘌呤核 苷-2'-、 -3'-、 或-5'-磷酸 鸟嘌呤核 苷-2'-、 -3'-、 或-5'-磷酸 胞嘧啶核 苷-2'-、 -3'-、 或-6'-磷酸 尿嘧啶核 苷-2'-、 -3'-、 或-7'-磷酸
图1
不同 OD600 值下细胞干重质量含量
3.3 用重组大肠杆菌 5 升发酵罐试验
将构造的工程菌接入 5L 发酵罐进行小批量发酵，间隔 1 小时取样测定，记录发酵状况。
表 3 10L 发酵罐间隔 1 小时状况记录
OD600 1 2 3 4 5 6 7 8 0.106 0.273 0.300 0.204 0.386 0.670 0.965 1.181
4
蛋白胨/% 1 0.8
酵母粉/% 0.4
体积/mL 30
发酵时间 /h 12
NaCl/g 0.3
接种量/mL 0.3
稀释 3 倍后 OD600 值 0.557
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2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 R
0.8 0.8 1.0 1.0 1.0 1.2 1.2 1.2 0.716 0.847 0.893 0.177
3.5 RNA 的制备和核苷酸的离子交换层析分离
3.5.1 酵母泥含水量及总交换容量的测定
酵母泥含水量 = 树脂含水量： W% = 静态法： 总交换当量 E ( 动态法： 总交换容量 E ( 毫克当量 克干树脂 )= 标准 HCl 当量浓度 × 耗用标准 HCl 毫升数 × 倍数(体积比) 树脂体积 × 湿真密度 × W 44 20 = 1.2 × 48.5% 0.1 × 5.6 × 毫克当量 克干树脂 )= 50N1 − 2N2 V2 50 × 0.0976 − 2 × 0.1 × 18.225 = = 1.9984 G(1 − W) 1.2 × (1 − 48.5%) G1－G2 29.99 − 29.02 × 100% = × 100% = 48.5% G1 2 湿酵母泥质量 − 干燥后酵母泥质量 湿酵母泥 = 10 − 2.39 = 76.1% 10
= 2.1168
3.5.2
核苷酸纯度及单核苷酸离子交换层析
核苷酸纯度测定：
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样品浓度 = RNA 含量 =
0.0260 × 106 = 52μg/mL 25 × 25/2.5 × 8/4 = （0.673 − 0.326）/0.02 = 33.4% 52
（甲OD260 − 乙OD260 ）/0.02（μg/mL） 样品浓度(������g/mL)
2 材料与方法
见《生物工程专业大实验指导书》
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3 结果
3.1 大肠杆菌基因工程菌株的构建
利用感受态大肠杆菌构建基因工程菌成功率不高，因此处理后的大肠杆菌在不同成分的培养基上会有 不同的生长状况。未转化的大肠杆菌因没有导入质粒上的抗性基因无法在含有 Amp 的培养基上生长。
表 1 大肠杆菌感受态细胞的转化及参照结果
0.5 0.6 0.4 0.5 0.6 0.4 0.5 0.6 0.700 0.826 0.967 0.267
40 50 40 50 30 50 30 40 0.786 0.861 0.857 0.075
14 16 16 12 14 14 16 12
0.4 0.5 0.4 0.5 0.3 0.5 0.3 0.4