北大医学部2010流式细胞术讲义
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【基础医学】第十七章 流式细胞术
第一节 基本原理
一、流式细胞仪的主要组件
1．液流系统 包括各种管道、压力调节 开关、液体流动室和超声振荡器喷嘴。单 个细胞悬液在狭窄的管道中流动，由于细 胞受流体力学的作用，极易形成贴边、堆 积,从而造成阻塞。为克服此种现象，利用 流体聚焦的原理，在不同的压力作用下使 鞘液〔通常用PBS〕和细胞悬液在喷嘴内 形成层流液束，通过细胞测量区。
〔2〕180g离心5min，小心吸出上清，然后 把沉淀的白细胞用细胞洗涤缓冲液洗两次， 80g离心5min。吸出上清，再把细胞悬浮在冷 的缓冲介质中备用。
〔二〕梯度-密度离心分离法 该方法可离出单个核细胞〔淋巴细胞和单
核细胞〕。 1．材料 淋巴细胞分离液；PBS缓冲液。
2．方法 〔1〕所用试剂预热到25℃以获得正确的密
二、组织
从新鲜组织制备单个细胞悬液，有的
比较容易，例如淋巴结组织用注射器反复 抽吸几次即可得到足够量的细胞；有的就 比较困难，常要用机械分散和酶消化相结 合的方法处理，如肝、睾丸用酶消化处理 很容易得到单个细胞。但睾丸生殖细胞胞 质之间桥接引起相邻细胞溶解，形成人为 的称为合胞体的多核假象。很难与DNA含 量和体积上相似的单个细胞区分开。神经 细胞的处理参见细胞培养。
〔3〕染色：离心10min去掉固定液，并再 悬浮细胞，加入ml染液，室温下染30min，上 机分析。
注意：使用激发波长457nm，发射波长约 大于515nm，使用515 Long Pass滤片。该方法 优点是不需RNA酶处理。
3．双间二氮茚〔Hoechst〕类染色法
Hoechst33258及Hoechst33342均为此类 染料，特异性与核酸的A-T键结合，但在的环境 条件下优先与RNA结合。测定DNA的染液配制， 需先以蒸馏水溶解后再以PBS稀释成1mmo1/L 的浓度，原液可在冰箱中避光保存，这种染液对 乙醇固定的细胞或死细胞可立即着色，对活细胞 需经20min左右才能达到饱和性着色。
临床医学技术培训PPT流式细胞术技术(1)
收集数据，进行定量和定性分 析。
流式细胞术的检测原理
细胞染色
使用荧光染料标记细胞 表面的抗原或内部的分
子。
细胞悬浮
将细胞悬浮在液流中， 通过喷嘴引入检测区域
。
激光照射
激光束照射细胞，激发 荧光染料发出荧光。
信号检测
检测器收集荧光和散射 光信号，转化为电信号
。
荧光染料的种类与选择
荧光染料种类
有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白 (PE)、罗丹明(Rhodamine)等。
疫苗研发
用于监测疫苗接种后免疫 细胞的反应和变化，评估 疫苗的有效性和安全性。
流式细胞术的发展历程
19世纪末期
流式细胞术的初步设想诞生。
20世纪60年代
第一代流式细胞仪问世，可以进行简单的 细胞计数和大小测量。
20世纪80年代
21世纪初
第二代流式细胞仪出现，引入荧光染色和 多参数检测技术，提高了检测的灵敏度和 特异性。
特点
具有高速度、高精度和高通量等 优点，能够同时检测多个细胞参 数，广泛应用于临床医学、生物 学和生物医学研究中。
流式细胞术的应用领域
01
02
03
临床诊断
用于检测血液系统疾病、 免疫系统疾病和肿瘤等， 如白血病、淋巴瘤和实体 瘤的分类和分型。
生物研究
用于研究细胞生长、分化 、凋亡和免疫应答等生物 学过程，以及药物筛选和 基因表达分析等。
荧光染料选择
根据抗原特异性和实验需求选择合适 的荧光染料，确保特异性标记和最佳 信号强度。
03
流式细胞术实验技术
样本的制备与保存
01
02
03
04
血液样本
采集静脉血液，使用抗凝剂， 避免溶血和细菌污染。
流式细胞术的检测原理
细胞染色
使用荧光染料标记细胞 表面的抗原或内部的分
子。
细胞悬浮
将细胞悬浮在液流中， 通过喷嘴引入检测区域
。
激光照射
激光束照射细胞，激发 荧光染料发出荧光。
信号检测
检测器收集荧光和散射 光信号，转化为电信号
。
荧光染料的种类与选择
荧光染料种类
有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白 (PE)、罗丹明(Rhodamine)等。
疫苗研发
用于监测疫苗接种后免疫 细胞的反应和变化，评估 疫苗的有效性和安全性。
流式细胞术的发展历程
19世纪末期
流式细胞术的初步设想诞生。
20世纪60年代
第一代流式细胞仪问世，可以进行简单的 细胞计数和大小测量。
20世纪80年代
21世纪初
第二代流式细胞仪出现，引入荧光染色和 多参数检测技术，提高了检测的灵敏度和 特异性。
特点
具有高速度、高精度和高通量等 优点，能够同时检测多个细胞参 数，广泛应用于临床医学、生物 学和生物医学研究中。
流式细胞术的应用领域
01
02
03
临床诊断
用于检测血液系统疾病、 免疫系统疾病和肿瘤等， 如白血病、淋巴瘤和实体 瘤的分类和分型。
生物研究
用于研究细胞生长、分化 、凋亡和免疫应答等生物 学过程，以及药物筛选和 基因表达分析等。
荧光染料选择
根据抗原特异性和实验需求选择合适 的荧光染料，确保特异性标记和最佳 信号强度。
03
流式细胞术实验技术
样本的制备与保存
01
02
03
04
血液样本
采集静脉血液，使用抗凝剂， 避免溶血和细菌污染。
流式细胞术讲义
髓系细胞和单核细胞
7
CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞及其分化程度
8
CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞及其分化程度
9
CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、NK细胞
10
CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP
❖ T细胞相关标志：
CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8
常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义
管号 1
三色标记McAb
MouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP
染色细胞及目的
阴性对照及设门
2
CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、部分早期髓系细胞
样本要求：
➢ 肝素抗凝骨髓3ml(或外周血) ➢ 每天上午送检 ➢ 收费：
➢ 70元/每个单抗(临床常规检测12个单抗)
❖ 干/祖细胞标志：
CD34、CA133
❖ 髓系标志：
CD33、CD13、CD11b、CD15、MPO
❖ B细胞相关标志：
CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIg
3
CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞
4
Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP 髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分T淋
巴系细胞
5
CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP
反映细胞分化程度
流式细胞术原理及应用通用课件
抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
流式细胞术 ppt课件
制备(如染色)无关。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术原理及应用ppt课件
•横坐标：道数 •纵坐标：细胞数
•横坐标：某细胞参数 相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
整理版课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 ✓超声振动器(15-100kHz) ✓液流充电系统 ✓高压偏转板 ✓收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
流式细胞术原理及应用
整理版课件
1
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
整理版课件
2
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
整理版课件
42
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性
整理版课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
整理版课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术医学知识讲座
旳处理措施
即时 多种细胞功能旳检测，髓系细胞旳免疫表型 ≤1h，4℃ 单核细胞表面抗原分析 ＜2h，4℃ 嗜酸性粒细胞表面抗原分析 ≤72h，淋巴细胞免疫表型与DNA倍数分析
• 样本制备过程中，防止温度旳反复升降 尤其是测细胞旳功能旳时候
• 荧光抗体要进行分装 • 使用前要15000g离心除去汇集体 • Fc受体阻断旳策略
利用荧光抗体
• 细胞调亡旳检测—caspase酶旳活化
利用caspase-3特异性旳荧光 底物PhiPhiLux-G2D1/7--AAD
核酸内切酶活化造成旳DNA断裂
• 细胞调亡旳检测— BrdU和PI
BrdU
PI
线粒体膜电位旳变化
• 细胞调亡旳检测—
–线粒体膜电位旳变化是细胞凋亡发生旳一种早期体现， 甚至于能够说是原因之一。脂溶性穿膜染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos 能够被流式细胞仪检测从而监测 线粒体膜电位旳变化.
实际上
PE
PE
PE-FITC
理论上
FITC
FITC
单管双标识
PE
PE
FITC
FITC
流式细胞仪—分选
流式细胞术应用
DNA含量旳检测--PI
细胞调亡旳检测 • 细胞会缩水变小，细胞内部颗粒会变多 • 细胞质膜内侧旳磷脂酰丝氨酸外翻造成旳细胞膜
不对称性消失 • 蛋白水解酶——Caspase酶旳活化 • 核酸内切酶活化造成旳DNA断裂 • 线粒体膜电位旳变化
–以JC-1为例,当ΔΨ变化时,JC-1旳发射光在红色和绿色 之间出现可逆旳变化,当ΔΨ高时,JC-1出现汇集而发红 光, ΔΨ低时,JC-1呈现单体而发绿光,流式检测线粒体膜 电位即能够定性:荧光发射波长旳变化;也能够定量:荧光 发射光旳强度
即时 多种细胞功能旳检测，髓系细胞旳免疫表型 ≤1h，4℃ 单核细胞表面抗原分析 ＜2h，4℃ 嗜酸性粒细胞表面抗原分析 ≤72h，淋巴细胞免疫表型与DNA倍数分析
• 样本制备过程中，防止温度旳反复升降 尤其是测细胞旳功能旳时候
• 荧光抗体要进行分装 • 使用前要15000g离心除去汇集体 • Fc受体阻断旳策略
利用荧光抗体
• 细胞调亡旳检测—caspase酶旳活化
利用caspase-3特异性旳荧光 底物PhiPhiLux-G2D1/7--AAD
核酸内切酶活化造成旳DNA断裂
• 细胞调亡旳检测— BrdU和PI
BrdU
PI
线粒体膜电位旳变化
• 细胞调亡旳检测—
–线粒体膜电位旳变化是细胞凋亡发生旳一种早期体现， 甚至于能够说是原因之一。脂溶性穿膜染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos 能够被流式细胞仪检测从而监测 线粒体膜电位旳变化.
实际上
PE
PE
PE-FITC
理论上
FITC
FITC
单管双标识
PE
PE
FITC
FITC
流式细胞仪—分选
流式细胞术应用
DNA含量旳检测--PI
细胞调亡旳检测 • 细胞会缩水变小，细胞内部颗粒会变多 • 细胞质膜内侧旳磷脂酰丝氨酸外翻造成旳细胞膜
不对称性消失 • 蛋白水解酶——Caspase酶旳活化 • 核酸内切酶活化造成旳DNA断裂 • 线粒体膜电位旳变化
–以JC-1为例,当ΔΨ变化时,JC-1旳发射光在红色和绿色 之间出现可逆旳变化,当ΔΨ高时,JC-1出现汇集而发红 光, ΔΨ低时,JC-1呈现单体而发绿光,流式检测线粒体膜 电位即能够定性:荧光发射波长旳变化;也能够定量:荧光 发射光旳强度
流式细胞术及其临床应用课件(1)
光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
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分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞内特异标记的荧光信号 从而测定细胞的多种生化物质（如膜表面受体、抗原、离子或 DNA/RNA表达等）特性的方法，同时也是一项可以把具有相同 荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的 细胞分析技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer）：是一种集激光技术、电
8
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医学部
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• 流式细胞仪的分类
临床型：光路调节系统固定，自动化程度高，操 作简便，易掌握， 适用于临床常规测试 科研型：分辨率高，选配多种波长和类型激光器， 可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板 上， 适用于科研
9
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流式细胞仪的结构与原理
流式细胞术和流式细胞仪器简介
流式细胞仪的结构
流式细胞术的信号检测原理
5
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• 什么是流式细胞术 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是 一种定量
Beckman公司的流式细胞分选仪
EPICS Altra
MoFlow Ⅰ
MoFlow XDP II
13
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细胞室流式仪介绍
FACS Calibur
FACS LSR
FACS Vantage SE
FACS Aria
14
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BD公司的流式细胞分析仪
FACS Calibur
FACS Canto
FACS Count
LSRII
10
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BD公司的流式细胞分选仪
FACSVantage & Diva
学出版社。2008.2
• 临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。
2005.8
• 实用流式细胞术彩色图谱。王书奎，周振英主编。上
海第二军医大学出版社。2004.4
• 流式细胞术的原理和应用。宋平根，李素文主编。北
京师范大学出版社。1992.3
• 流式细胞术。贾永蕊编。化学工业出版社。2009.3
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流式细胞仪的结构与原理
流式细胞术和流式细胞仪简介
流式细胞仪的结构
流式细胞术的信号检测原理
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• 流式细胞仪内部结构
光学系统 激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换器 数据处理系统 细胞分选系统 喷嘴 电偏转板 样品收集器
流 式 细 胞 术
苏
黎
北京大学医药卫生分析中心 细胞分析室
教学公用邮箱：cell-2009@ 密码：82802389 联 系 电 话：82802437，82805034
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教学参考书
• 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医
子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技 术、抗体技术为一体的新型高科技仪器。
6
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流式细胞术的特点
分析对象：单细胞悬液或生物颗粒
分析速度：快速，最高达上万个细胞/秒
检测参数：多参数（两个散射光参数、多个荧光参数） 可同时测定多种可溶性细胞成分：流式微球芯片技术（Cytometric Beads Array,CBA） 检测结果：精度高、准确性好 先进的细胞定量技术
7
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• 流式细胞仪的发展及商品化
1970年：Phywe研制脉冲细胞光度计，备有荧光镜的FCM， DNA定量；同年Kamensky发明白细胞分类流式细胞仪，激 光光源，吖啶橙染色，测定淋巴、单核、中性粒C 1972年：Len Herzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分 选仪（FACS），氩离子激光，标志着流式细胞仪商品化 时代到来 1973年：Becton Dikinson (BD)公司投入市场，第一台 FACS-Ⅰ 问世，其后20多年来不断改进完善产品，先后推出 FACSAnalyzer、FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-Ⅱ、 FACSVantage、FACSDiva、FACSAria等 1975年：Coulter公司TPS-1问世，可做双参数分析，随后不断推 出各种型号仪器，EPICS –C、EPICS-Profile、EPICSELITE等 1994年：美国Cytomation公司推出高性能、高速分选装置 MoFlo，该机以出色的性能和创新设计理念，一经推出即受 到广泛关注 2008年，美国BD公司推出Influx，在MoFlo基础上实现了原位、 立体分选
2
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3
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流式细胞仪的结构与原理
流式细胞术的数据获取与分析
流式细胞术的样本制备 流式细胞术的应用 流式分选原理及其应用 流式细胞术的优越性与展望
Influx™ FACS Aria™ Ⅱ
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Beckman公司的流式细胞分析仪
EPICS XL/XL-MCL
CytomicsTM FC 500
CyAn ADP
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流式细胞仪（Flow Cytometer）：是一种集激光技术、电
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• 流式细胞仪的分类
临床型：光路调节系统固定，自动化程度高，操 作简便，易掌握， 适用于临床常规测试 科研型：分辨率高，选配多种波长和类型激光器， 可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板 上， 适用于科研
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流式细胞仪的结构与原理
流式细胞术和流式细胞仪器简介
流式细胞仪的结构
流式细胞术的信号检测原理
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• 什么是流式细胞术 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是 一种定量
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EPICS Altra
MoFlow Ⅰ
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细胞室流式仪介绍
FACS Calibur
FACS LSR
FACS Vantage SE
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FACS Calibur
FACS Canto
FACS Count
LSRII
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BD公司的流式细胞分选仪
FACSVantage & Diva
学出版社。2008.2
• 临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。
2005.8
• 实用流式细胞术彩色图谱。王书奎，周振英主编。上
海第二军医大学出版社。2004.4
• 流式细胞术的原理和应用。宋平根，李素文主编。北
京师范大学出版社。1992.3
• 流式细胞术。贾永蕊编。化学工业出版社。2009.3
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流式细胞仪的结构与原理
流式细胞术和流式细胞仪简介
流式细胞仪的结构
流式细胞术的信号检测原理
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• 流式细胞仪内部结构
光学系统 激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换器 数据处理系统 细胞分选系统 喷嘴 电偏转板 样品收集器
流 式 细 胞 术
苏
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北京大学医药卫生分析中心 细胞分析室
教学公用邮箱：cell-2009@ 密码：82802389 联 系 电 话：82802437，82805034
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教学参考书
• 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医
子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技 术、抗体技术为一体的新型高科技仪器。
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流式细胞术的特点
分析对象：单细胞悬液或生物颗粒
分析速度：快速，最高达上万个细胞/秒
检测参数：多参数（两个散射光参数、多个荧光参数） 可同时测定多种可溶性细胞成分：流式微球芯片技术（Cytometric Beads Array,CBA） 检测结果：精度高、准确性好 先进的细胞定量技术
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• 流式细胞仪的发展及商品化
1970年：Phywe研制脉冲细胞光度计，备有荧光镜的FCM， DNA定量；同年Kamensky发明白细胞分类流式细胞仪，激 光光源，吖啶橙染色，测定淋巴、单核、中性粒C 1972年：Len Herzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分 选仪（FACS），氩离子激光，标志着流式细胞仪商品化 时代到来 1973年：Becton Dikinson (BD)公司投入市场，第一台 FACS-Ⅰ 问世，其后20多年来不断改进完善产品，先后推出 FACSAnalyzer、FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-Ⅱ、 FACSVantage、FACSDiva、FACSAria等 1975年：Coulter公司TPS-1问世，可做双参数分析，随后不断推 出各种型号仪器，EPICS –C、EPICS-Profile、EPICSELITE等 1994年：美国Cytomation公司推出高性能、高速分选装置 MoFlo，该机以出色的性能和创新设计理念，一经推出即受 到广泛关注 2008年，美国BD公司推出Influx，在MoFlo基础上实现了原位、 立体分选
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流式细胞仪的结构与原理
流式细胞术的数据获取与分析
流式细胞术的样本制备 流式细胞术的应用 流式分选原理及其应用 流式细胞术的优越性与展望
Influx™ FACS Aria™ Ⅱ
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Beckman公司的流式细胞分析仪
EPICS XL/XL-MCL
CytomicsTM FC 500
CyAn ADP
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