流式细胞术质量控
(完整版)精准检验对流式细胞术的发展和质量控制要求
精准检验对流式细胞术发展和质量控制需求盛慧明2016年11月11日一、流式细胞术发展历史和现状二、流式细胞术的最新进展三、BEAMing技术四、流式细胞术的质量控制一、流式细胞术发展历史和现状二、流式细胞术的最新进展三、BEAMing技术四、流式细胞术的质量控制一、流式细胞术发展历史和现状流式细胞术Flow Cytometry现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代，源于对细胞进行分选，所以最早是Fluorescence-activated cell sorting ，FACS；最早的omic 经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟并不断推陈出新，广泛运用于从基础研究到临床实践的各个方面；是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术；流式细胞术技术平台涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。
流式细胞术完成FCM计数的主要历程◆1930年,Casperrsson 和Thorell 开始致力于细胞的计数;◆1934年,Moldaven 是世界上最早通过光电仪记录细胞数量;◆1940年,Coons 提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白;◆1953年,Croslannd Taylor 应用分层鞘流原理,奠定了流式细胞术的液流技术基础;◆1956年,Coulter 生产了Coulter细胞颗粒计数器;◆1953年,Parker 和Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形;◆1967年, Holm 等设计了汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电设备计数的装置;◆1973年, Steinkmp设计了利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，达到计数和分选的装置.流式细胞术完成数据采集和分析技术整合◆1965年，Kamentsky开拓性的提出两大设想：:(1) 用分光光度计定量细胞成分; (2)结合测量值对细胞进行分类;◆1969年,Van Dilla 和美国的Los Alamos小组研制出液流束、光路轴、检测系统光轴三者相互正交的第一台流式细胞计数器；◆1972年, Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;◆1973年，与Stanford University合作开发世界上第一台商用流式细胞仪FACSI.Kamentsky Herzenberg流式细胞仪的基本构造流式细胞采用的抗体常用荧光素：•FITC,激发光488nm 发射光525nm；•PE,激发光488nm 发射光575nm;•PE-Cy5,激发光488nm 发射光667nm;•PE-Cy7,激发光488nm 发射光767nm。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术是一种在液流中快速检测和分析细胞特性的技术，广泛应用于医学、生物技术、免疫学等领域。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，必须实施严格的质量控制措施。
本文将探讨流式细胞术的质量控制。
1、样本制备的质量控制样本制备是流式细胞术的关键步骤之一，包括细胞样本的收集、处理和标记。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）样本的收集和保存：应尽可能缩短样本采集到分析的时间，避免细胞状态的改变。
对于血液样本，应使用肝素抗凝，避免细胞聚集。
（2）细胞的分离和洗涤：应根据实验需求，采用合适的分离方法（如密度梯度离心法、贴壁培养法等）对细胞进行分离。
在洗涤过程中，应使用无菌、无内毒素的缓冲液洗涤细胞，去除杂质和死细胞。
（3）抗体标记：选择高质量的抗体，并遵循制造商的建议进行标记。
应避免抗体非特异性结合，确保标记的特异性和敏感性。
2、仪器设备的质量控制流式细胞仪是流式细胞术的核心设备。
为确保实验结果的准确性，应对仪器进行定期校准和维护。
具体措施包括：（1）校准激光功率：定期使用标准样本对激光功率进行校准，确保光路准直，提高光散射数据的准确性。
（2）清洗流动室：定期清洗流动室，防止样品残留物堵塞喷嘴，影响流速稳定性。
（3）校准光电倍增管：使用标准样本校准光电倍增管，确保光电倍增管输出的线性范围。
3、数据分析的质量控制数据分析是流式细胞术的关键步骤之一，包括数据的获取、处理和解析。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）数据获取：设置合适的参数和门控，确保获取最佳的数据。
（2）数据预处理：去除噪声和无效数据，进行数据归一化处理，提高数据质量。
（3）数据分析：选择合适的数据分析方法（如聚类分析、主成分分析等），对数据进行深入挖掘。
同时，应使用多个对照样本，评估实验结果的可靠性和稳定性。
4、实验室环境的质量控制实验室环境对流式细胞术的结果也有重要影响。
为确保实验结果的准确性，应采取以下措施：（1）温度控制：保持实验室温度稳定，避免温度波动对细胞状态的影响。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术的质量控制一、引言流式细胞术是一种重要的细胞分析技术，可以用于细胞计数、细胞表型分析和细胞排序等。
在进行流式细胞术之前，进行质量控制是非常重要的，以确保实验的准确性和可靠性。
本文将详细介绍流式细胞术的质量控制方法。
二、仪器校准⒈流式细胞仪校准●清洁流式细胞仪的样品室，并检查激光器和光路系统是否正常工作。
●使用粒子标准物质检查细胞仪的散射、荧光和时间参数的准确性。
●清洗和校准流式细胞仪的液体系统，确保流速和样本量的准确控制。
⒉样品准备●均匀悬浮细胞样本，避免细胞团聚和沉积。
可通过离心和重新悬浮样本来实现。
●使用质量可靠的细胞染色方法，确保染色的准确性和一致性。
●调整样本的浓度，以避免过度聚焦和细胞过于稀疏而损失信号。
三、质量控制指标⒈样本纯度的质量控制●使用合适的负对照和正对照来评估染色的纯度。
例如，使用未染色细胞作为负对照，使用已知阳性标记的细胞作为正对照。
●定期检查染色结果的一致性，确保负对照细胞没有阳性标记，正对照细胞有预期的阳性标记。
⒉流式细胞仪性能的质量控制●定期检查流式细胞仪的性能参数，包括散射灵敏度、荧光检测灵敏度和时间分辨率。
●使用校准颗粒检验流速的准确性和一致性。
●根据实验需要，使用合适的质检颗粒进行分辨率和强度的调整。
四、数据分析和结果解释⒈数据质量控制●检查数据文件的完整性，确保数据文件包含所有需要的参数和样本。
●清除实验过程中的噪声信号和非特异性染色的细胞。
●根据预设的阈值和门控策略进行数据清洗和筛选。
⒉数据解释和结果报告●根据实验的目的和结果，选择合适的数据可视化方法，如频率直方图、散点图或密度图等。
●在报告中注明样本总数、阳性细胞比例、细胞亚群的比例等相关指标。
●提供结果的解释和分析，例如细胞表型的变化趋势、不同实验组间的比较等。
五、附件附件1、样本染色方案附件2、流式细胞仪校准记录表附件3、数据分析结果表格六、法律名词及注释⒈ IRB：Institutional Review Board，即伦理审查委员会，负责审查人体试验和研究项目的合法性和伦理性问题。
流式细胞仪质量控制及常见问题处理-薛向军
全血细胞裂解时的散射光
嗜碱细胞 粒细胞 嗜酸细胞 侧向散射光
嗜中性细胞
单核细胞
淋巴细胞 前向散射光
Mid 1980’s
应用双向散射光时细胞形态学存在的固有问题
粒细胞
SS
单核细胞
淋巴 / 单核细胞大小分布的重叠
1.0
淋巴细胞
.8 .6 .4 .2
FS
淋巴细胞点图
大淋巴细胞
小单核细胞
0
8 9 10 11 12
R>0.98
系统性能参数----分辨率
质控: 分辨率, 能量输出 手段: 校准标准物（Flow Check or CaliBrite Beads), 为高度均 一 并具有高荧光强度的单一群体 应用: 通过记录PMT电压和峰的%CV, 作Levey-Jenning 图来达 到监测激光输出的目的 功能: 核实仪器的校准, 检验光路、流路是否稳定
数据的获取和分析
•第一，细胞获取数量
•第二，阈值的设立通道和大小 •第三，分析区域 •第三，其它有用的参数，如平均荧光强度，荧光强度中位 数，CV，细胞浓度等
可靠性的核实
T SUM: %CD3+4+ + %CD3+8+ = %CD3 ± 5% T 细胞的平行测定 2% LYMPHOSUM: CD3+ + CD19+ + NK = 100% ± 5% 荧光微球的流速（样本内质控）
y=Mx^B
R-squared = C C
DETECTION LEVEL
M
value
188.09
B
value
0.9472
value
0.9918
流式细胞术的质量控制
⑷ DNA二倍体标准不稳定，Schutter等发现用新鲜正 常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞 DNA含量 (例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等)作为石蜡包埋组 织细胞DNA含量的标准不适用，石蜡包埋组织比新 鲜组织细胞DNA荧光强度低，且样品间的荧光强度 不稳定，解决DNA二倍体标准不稳定的办法，可将 正常组织与肿瘤组织作为一个内标的二倍体标准参 照，可减少DNA倍体分析的误差，对存档中的石蜡 包埋组织材料，可以采用正常组织石蜡包埋标本， 作为一个外参的二倍体标准，但要求采用的外参二 倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品(例如鸡血细 胞等)。
流式细胞术的质量控 制和影响因素
河北省肿瘤研究所 左连富
一、标本的采集和固定方法的质量控制
标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程， 需注意： ①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要 避免出血坏死组织。 ②标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织 发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。 ③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。
ห้องสมุดไป่ตู้
在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石 蜡可，影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的 方法是弃去二甲苯(Hedley强调用Histoclear，即 组织清洗剂代替二甲苯脱蜡，效果更好)，加入 100%乙醇，如果无絮状物浮起，示蜡已脱净 梯度酒精(100% 70% 50%)水化要充分,使组织还 原到与新鲜组织相似的状态。 消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等，不 造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要，时间 短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又 被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用 0.5%胃蛋白酶PH 1.5。
二、单细胞悬液制备的质量控制
白血病微小残留检测及其质量控制(流式细胞术)
2. 流式细胞术是直接进行定量，更为精确；而PCR是根据 产物的量进行推算。
3. 流式细胞术检测时可以区别活细胞和经化疗将要死亡的 细胞以及死亡细胞的碎片（而这些死亡的细胞以及细胞 碎片在PCR检测中都可能形成阳性信号）。
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
Fluorescent Standard
Obtain Results
Troubleshoot Maintenance
Color Compensation
Generate Report
FAIL
Process/ Method Control
PASS
Test Reimbursement
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
Elaine Coustan-Smith, etal. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2000, 96(8):2691-2696
流式细胞术检测白血病MRD原理
利用抗原表达的差异，以直观的方式区分白血病 细胞和正常的骨髓细胞（正常生理状态下和骨髓重建期）
跨系表达的抗原 质的差异 时相混乱的抗原 与染色体异常相关的抗原 抗原表达量异常高 量的差异 抗原表达量异常低
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
差异
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术的质量控制介绍:流式细胞术是一种广泛应用于生物学研究中的实验技术。
它利用机器读取细胞表面或细胞内的特定标记以获得细胞的详细信息。
在进行流式细胞术之前，需要进行一系列的质量控制步骤来确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍流式细胞术中的质量控制步骤。
⒈样本制备和处理⑴样本收集和保存●确保样本采集时的准确性和一致性，尽量避免引起细胞损伤或死亡的因素。
●根据所选择的荧光探针或抗体，选择合适的保存液保存样本，并按照推荐的存储温度和时间进行保存。
⑵细胞处理●避免细胞在处理过程中受到机械或酶的损伤。
选择适当的细胞处理方法（如胶凝、裂解或染色）。
⒉样本质量控制⑴细胞数目和浓度●使用细胞计数仪或显微镜对观察区域内的细胞进行计数，并计算细胞的浓度。
⑵细胞活性●使用细胞活性染料（如细胞渗透性染料）检测细胞的活性。
确保细胞在实验过程中保持完整和活跃。
⑶细胞纯度●利用细胞表面标记物或细胞核染色物进行细胞表型分析，以检测细胞样品中的污染物。
⑷细胞均一性●对样本进行混合和搅拌，确保细胞在整个样本中均匀分布。
⒊仪器校准和控制⑴流式细胞仪校准●使用流式细胞仪提供的校准粒子进行仪器校准，包括流速、散射光校准和荧光信号校准等。
⑵仪器控制●使用流式细胞仪的软件设置合适的参数，如触发门、荧光通道选择和数据采集速率。
⒋数据分析和解释⑴数据收集●使用流式细胞仪采集样本数据，并确保数据的完整性和正确性。
⑵数据分析●使用专业的数据分析软件对采集到的数据进行分析和解释。
⑶数据报告●根据实验需求和要求，使用适当的图形、表格和文本来呈现数据结果。
附件：⒈样本收集和保存记录表⒉样本质量控制记录表⒊仪器校准记录表法律名词及注释：⒈样本：指用于流式细胞术的生物样本，如细胞悬液或洗涤液。
⒉流式细胞仪：一种用于分析和计数细胞的仪器，透过仪器对细胞进行流式测量。
⒊标记物：用于识别和分析特定细胞类型或分子的抗体或染料。
⒋数据分析软件：用于处理流式细胞术数据并图形和数据表的计算机程序。
流式细胞术质量控制
流式细胞术质量控制流式细胞术（flow cytometry,FCM）越来越广泛的应用在临床检验中。
由于临床检验本身的性质，它要求临床检验的管理者和操作人员必须把好常规操作已经结果分析的质量关。
同时还必须懂得如何判断分是在控还是失控。
作为临床检验工作，其工作的质量标准就是使检验的结果最佳地符合病人有无病变的实际情况。
在临床检验中分为分析前、分析中、分析后的质量控制。
分析前的质量控制主要内容是标本采集、保存和传送等；分析中的质量控制即实验操作过程的控制；分析后的质量控制主要是对数据结果的处理，对检验结果的可信度评价和及时将报告送给临床并听取反馈意见。
为此，从临床医师开出化验单，，直至拿到检验报告的整个过程都在质量控制的范畴之中，即所谓全程质量控制。
它包括质量保证、质量控制和质量评估。
质量保证，指围绕所有的步骤，监测和评估实验室规章制度与操作流程的效力。
主要利用质量控制和质量评估。
质量控制指建立一套完善的实验室监控方法，保证结果的可靠性，提高准确度、精密度、重复性和室间结果的可比性。
对于一个实验，应建立一套包括各种可变因素（仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等）的操作规程。
质量评估是由一个区域性的、国家的或国际性的机构，组织通过一系列的方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。
其主要目的是建立室间和仪器设备之间的可比性。
当一个标准品或参考标准存在时，质量评估通常被称为熟练度测试。
因此，严格的质量控制是先进的临床检验分析技术真正发挥作用的保证。
FCM作为一项先进的检测技术，对质量控制自然也不例外。
目前，FCM应用于临床检验的项目主要集中在几个方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴细胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27检测、阵发性血红蛋白尿（PNH）的检测等等。
2，细胞DNA、RNA检测及细胞周期分析，包括DNA倍体检测、细胞周期分析、网织红细胞检测、网织血小板检测等等。
光谱流式质控
光谱流式质控
光谱流式质控是一种用于评估流式细胞术实验数据质量的方法。
光谱流式细胞术是一种基于激光技术的高速、高分辨率地分析细胞数量和表型的技术。
在光谱流式细胞术实验中，质控至关重要，因为它可以帮助研究人员确保实验数据的准确性和可重复性。
光谱流式质控的主要目的是：
1.检测仪器性能：检查仪器在实验过程中的稳定性、精度和分辨率。
这有助于确保实验结果的可靠性和准确性。
2.优化实验条件：通过监测实验过程中各项参数的变化，及时调整仪器设置和实验条件，以获得更好的实验效果。
3.评估样本质量：通过对样本进行质控分析，评估样本的可靠性和适用性，从而确保实验结果的准确性。
4.检测实验操作误差：检查实验操作过程中可能出现的误差，以确保实验的重复性和可靠性。
光谱流式质控的具体步骤如下：
1.准备质控样本：选择具有已知特征的质控细胞，如荧光标记的细胞系或特定抗原表达的细胞。
2.进行实验：按照常规的光谱流式细胞术实验流程，对质控样本进行检测。
3.数据采集：在实验过程中，实时采集光谱流式细胞术的数据。
4.数据分析：对采集到的数据进行预处理和分析，评估实验结果的质量。
5.设定质控标准：根据实验结果，设定合适的质控标准，以判断实验数据的可靠性。
6. 评估实验结果：将实验数据与质控标准进行比较，评估实验结果的质量和可靠性。
7.优化实验条件：根据质控结果，及时调整实验条件，以提高实验数据的质量。
通过实施光谱流式质控，研究人员可以确保实验数据的准确性和可重复性，从而为后续的生物分析和临床应用提供可靠的依据。
在实际应用中，光谱流式质控方法可以根据实验需求和仪器特性进行调整和优化。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的细胞分析技术。
它通过利用光传感器和激光来检测细胞悬浮液中的细胞数量、大小、形态和表面标记物等信息，从而实现对细胞的分析和分类。
为了保障流式细胞术的准确性和可重复性，质量控制是非常重要的。
样本制备的质量控制在进行流式细胞术之前，样本制备是流式细胞术质量控制的第一步。
样本质量对于结果的准确性和可重复性至关重要。
以下是一些常见的样本制备质量控制步骤：细胞样品准备细胞浓度的准确计数：使用细胞计数仪准确计数细胞数目，以确保每个样本含有足够数量的细胞进行分析。
细胞的适当处理：根据不同实验要求，对细胞进行适当的处理，如洗涤、培养基的选择等，以确保细胞状态的一致性。
样品标记物的质量控制标记物的选择：根据实验需要，选择合适的标记物，并确保其特异性、亲和力和荧光强度等符合要求。
样品标记物的浓度和时间：对于标记物的浓度和反应时间进行优化，避免过高或过低的浓度导致信号失真或信号强度不足。
流式细胞仪的质量控制流式细胞仪作为流式细胞术的核心仪器，其性能的稳定和准确也是流式细胞术质量控制的关键。
以下是常见的流式细胞仪质量控制步骤：光谱校正与补偿荧光信号校正：使用校正颗粒进行荧光信号校正，校正光谱重叠和荧光强度的变化，以提高结果的准确性。
荧光信号补偿：通过对不同通道之间的荧光信号进行补偿，避免荧光信号之间的交叉干扰，确保结果的准确性。
流速标定流速标定：使用标定颗粒进行流速标定，保证流速的准确性，以便对细胞进行准确的定位和计数。
指标质量控制正质量控制：使用已知正样本进行实验，确保仪器的稳定性和结果的准确性。
负质量控制：使用未标记的负样本进行实验，排除背景信号和非特异性结合，保证结果的准确性。
识别和排除异物：通过故障检查和核查流式细胞术结果，识别和排除可能存在的污染源和异常情况。
数据分析的质量控制流式细胞术之后，对数据的准确分析和解读也是质量控制的重要环节。
流式细胞术质量控
流式细胞术质量控预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制一、流式细胞术常规项目操作流程二、样本采集和处理些？荧光染色的两种方法意义和注意事项是什么？三、免疫荧光染色3．单克隆抗体的质量控制IVD抗体和ASR试剂，是临床常规项目的首选抗体，性能参数符合临床常规检测要求，已经对两种抗体的特异性、灵敏度、精密度、适用范围进行了验证。
对于商品化质控物可以帮助监测部分单抗的检测效率，如淋系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数、细胞绝对荧光强度、阳性表达、可以作为CD55和CD59抗体的阳性对照和室内质控物。
对于自做阳性或阴性质控物，监测单克隆抗体的质量。
因为有些抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，如健康人红细胞和中性粒细胞膜上CD55和CD59，在正常人中是阳性表达，可作为阳性对照和室内质控物。
（二）荧光染色方法1．细胞膜免疫荧光染色大多数免疫表型分析是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。
正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液的目的，保证细胞膜表面抗原活性不被破坏；防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰。
注意事项：红细胞裂解或分离后至少洗涤1次；减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰；进行绝对计数抗原表达量时，不能洗涤红细胞裂解液，因不能改变初始细胞浓度。
2．细胞内免疫荧光染色细胞内免疫荧光染色是采用荧光素或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法。
他的意义在于诊断疾病和判断预后；细胞内髓性过氧化物酶（MPO）、CD3和CD79a的表达帮助白血病免疫分型。
细胞内染色的关键之处，是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性；细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记；确保固定和透膜的步骤不影响抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合。
细胞内免疫荧光染色的破膜剂有皂角素和70％冷乙醇，皂角素最常用最稳定。
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。
该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。
本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。
当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法1.1 标本收集收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。
由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。
本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。
目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。
4 讨论流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术的质量控制1、引言1.1 背景1.2 目的1.3 范围2、流式细胞术概述2.1 原理2.2 流程2.2.1 样本准备2.2.2 样本标记2.2.3 流式细胞仪设置2.2.4 数据采集2.2.5 数据分析3、质量控制流程3.1 样本质量控制3.1.1 样本准备的要求3.1.2 样本处理的注意事项 3.2 仪器质量控制3.2.1 日常仪器维护3.2.2 校准珠的使用3.3 标记质量控制3.3.1 阴性对照样本的选取 3.3.2 正性对照样本的选取 3.3.3 标记反应的优化3.4 数据质量控制3.4.1 检查数据完整性3.4.2 数据质量评估3.4.3 数据异常处理4、质量控制指标4.1 样本接受率4.2 样本处理成功率4.3 仪器运行状况4.4 标记反应效果4.5 数据完整性4.6 数据准确性5、质量控制记录5.1 样本质量控制记录5.2 仪器质量控制记录5.3 标记质量控制记录5.4 数据质量控制记录6、附件附件1、样本准备要求清单附件2、仪器维护流程图附件3、标记质量控制对照表附件4、数据质量评估标准注释:法律名词及其注释1、流式细胞术：一种利用流式细胞仪对细胞进行分析和排序的技术。
2、质量控制：指采取一系列措施，确保流式细胞术过程中的样本、仪器、标记和数据的质量达到一定要求。
3、样本准备要求清单：包括对样本的收集、保存、处理等要求的清单。
4、仪器维护流程图：说明日常仪器维护的步骤和方法的流程图。
5、标记质量控制对照表：记录每次标记实验中所选用的阴性对照样本、正性对照样本和标记条件的表格。
6、数据质量评估标准：用于评估数据质量的标准，包括数据完整性、数据准确性等指标。
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流式细胞术在制药质量控制中的应用
流式细胞术在制药质量控制中的应用下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料介绍流式细胞仪是一种常见的生物学实验仪器，可用于快速分析、定量和分选单个细胞。
它以极高的灵敏性和精度，使其成为现代生命科学中最重要的工具之一。
流式细胞仪的应用范围非常广，包括细胞免疫学、药理学、细胞周期分析、基因表达分析等等。
本文档旨在介绍流式细胞仪的基本工作原理、检测技术和质量控制方法。
工作原理流式细胞仪通过吸收、散射和荧光等特定光学信号来检测和分析细胞。
它的核心组成部分是荧光染料和激发光源，荧光染料可以与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物，激发光源可以激活荧光染料的荧光信号。
当样品通过流式细胞仪时，细胞和细胞复合物被单独地呈现在流体中，并且被一个聚光镜系列扫描，采集特定的光学信号。
通过分析该信号，流式细胞仪可以确定每个单一细胞的荧光特性。
检测技术荧光检测流式细胞仪常用的检测方法是荧光检测。
它需要将荧光染料与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物。
流式细胞仪将样品置于聚光镜下，激发光源激活荧光染料的荧光信号，然后通过聚光镜采集荧光信号。
荧光检测既可以用来鉴定单个表面标记物，也可以用于检测内部标记。
散射检测散射检测是流式细胞仪的另一种找出单个细胞的方式。
散射检测基于细胞对激光束的散射表现，散射强度既可以用来区分不同类型的细胞，也可以用于估计细胞的大小、形状和结构。
生物素-亲合素检测生物素-亲合素检测是流式细胞仪常用的一种检测方法。
生物素-亲合素检测通过不同的化学偶联对荧光染料进行标记，使得检测定量更加精确。
质量控制流式细胞仪的检测结果受多种因素的影响，因此需要严格的质量控制程序来保证检测结果的准确性和可靠性。
质量控制程序包括实验前的设备校准和实验后的数据分析。
设备校准设备校准是流式细胞仪保证检测结果准确性和可靠性的关键。
光学器件需要定期校准，以确保检测的性能和准确性。
每个荧光探针必须进行校准，以确保正确的基线水平和探针强度。
数据分析数据分析是流式细胞仪质量控制的另一关键步骤。
流式细胞术应用中的质量控制(徐翀)
流式细胞术应用中的质量控制徐 翀上海市临床检验中心Leonard A. Herzenberg荣获2006年京都奖（Kyoto Prize ）1.荧光抗体识别细胞表达的抗原2.荧光染料3.荧光标记核酸探针杂交4.微球捕获技术检测可溶性分子流式细胞术的技术应用原理FCM 在临床医学领域中的应用（国内）Ø淋巴细胞亚群、造血干细胞及其他免疫细胞检测Ø血液/淋巴系统肿瘤免疫分型和微小残留监测Ø红细胞疾病检测Ø细胞周期和DNA 倍体分析Ø液相多重蛋白定量FCM 在临床医学领域中的应用（欧洲）Accreditation of flow cytometry in Europe. Cytometry Part B. 2013; 84B: 135-142ICCS, CLSI/ICSH 标准和指南类别国外国内法规性文件，未具体涉及到流式检测方法Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988. (CLIA’ 88, 1988, 2003)《医疗机构临床实验室管理办法》，2006，中华人民共和国卫生部涉及流式检测方法通用标准或规则，未涉及具体检测项目Validation of Cell-based Fluorescence Assays:Practice Guidelines from the ICSH and ICCS, 2013; Canadian Guidelines for flow cytometric immunophenotyping. 2001《流式细胞术临床应用的建议》，2013，中华医学会检验医学分会/卫生部临床检验中心/中华检验医学杂志编辑委员会涉及流式具体检测项目免疫细胞计数：Guideline for Flow Cytometric Immunophenotyping , 1993, NIAID-DAIDS; CLSI H42-A2-2007;白血病/淋巴瘤：Revised guideline onimmunophenotyping in acute leukaemias and chronic lymphoproliferative disorders. 2002, BCSH;CLSI H43-A2-2007;Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. 2014, BCSH红细胞：ICSH H44-A2-2010；Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry.CLSI H52-A2-2014《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》，WS/T 360-2011，中华人民共和国卫生部《四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（2015版）》, 中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组Validation of Cell-based Fluorescence Assays: PracticeGuidelines from the ICSH and ICCSØRationale and Aims (pages 282-285)ØPre-Analytic (pages 286-290)ØAnalytic (pages 291-308)ØPost-Analytic (pages 309-314)ØAssay Performance Criteria (pages 315-323)全面质量管理Ø分析前质量控制按照时间顺序，从临床医生开出医嘱开始，到分析检验程序时终止的步骤，包括检验申请、患者的准备、原始样品的采集、运送到实验室并在实验室进行传输。
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一、流式细胞术常规项目操作流程
二、样本采集和处理
些？荧光染色的两种方法意义和注意事项是什么？
三、免疫荧光染色
3．单克隆抗体的质量控制
IVD抗体和ASR试剂，是临床常规项目的首选抗体，性能参数符合临床常规检测要求，已经对两种抗体的特异性、灵敏度、精密度、适用范围进行了验证。
对于商品化质控物可以帮助监测部分单抗的检测效率，如淋系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数、细胞绝对荧光强度、阳性表达、可以作为CD55和CD59抗体的阳性对照和室内质控物。
对于自做阳性或阴性质控物，监测单克隆抗体的质量。
因为有些抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，如健康人红细胞和中性粒细胞膜上CD55和CD59，在正常人中是阳性表达，可作为阳性对照和室内质控物。
（二）荧光染色方法
1．细胞膜免疫荧光染色
大多数免疫表型分析是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。
正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液的目的，保证细胞膜表面抗原活性不被破坏；防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰。
注意事项：红细胞裂解或分离后至少洗涤1次；减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰；进行绝对计数抗原表达量时，不能洗涤红细胞裂解液，因不能改变初始细胞浓度。
2．细胞内免疫荧光染色
细胞内免疫荧光染色是采用荧光素或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法。
他的意义在于诊断疾病和判断预后；细胞内髓性过氧化物酶（MPO）、CD3和CD79a的表达帮助白血病免疫分型。
细胞内染色的关键之处，是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性；细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记；确保固定和透膜的步骤不影响抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合。
细胞内免疫荧光染色的破膜剂有皂角素和70％冷乙醇，皂角素最常用最稳定。
70％冷乙醇用于PI与细胞内DNA结合分析细胞倍体和周期时相。
需要注意的是，细胞内染色与细胞活性检测不能同时进行；当荧光染料分子的颗粒足够小时，细胞内染色不需要破膜也可以进行，活细胞染料DAPI、TO和AO等对细胞内核酸染色。
（三）免疫荧光染色的注意事项
1．免疫荧光染色制备样本的保存
避光保存，避光的目的是避免荧光淬灭，整个荧光染色过程和流式细胞仪测定前都要避光。
染色完成后标本保存在4ºC下，并且尽快在4小时内完成测定。
不能在短时间内测定的保存在终浓度为1％多聚甲醛溶液，但最多保存至72小时。
2．对照设置
对照设置分为两类，一，用于设定流式细胞仪的检测阈值，有同型对照、空白对照和正常对照。
二，用于监测抗体和试剂的质量及整个实验过程，类似于质控品，有阳性对照、阴性对照和正常对照。
（1）同型对照
同型对照理论上是理想的对照，用来监测细胞自发荧光和抗体的非特异结合，实际使用时与测试抗体
关于细胞内免疫荧光染色说法错误的是（ ）
点？并简述一下数据获取和分析？
四、流式细胞仪性能和校准
流式细胞仪性能和校准，一，性能指标，精密度及其校准微球、
灵敏度及其校准微球、准确度及其校准、荧光补偿调整及校准结果的
记录和解析。
二，数据获取和分析，设门、分析和报告参数。
（一）性能指标的评价
性能指标的评价顺序是精密度、灵敏度、准确度。
校准内容有液
路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转
换的线性和稳定性。
校准品是标准微球，它的原材料是聚苯乙烯，被
制成各种大小或同时拥有定量免疫球蛋白结合位点的荧光微球，固定荧光强度、大小和光散射性，已成为流式细胞仪质控中的常用标准品。
如图所示为流式细胞仪。
1．精密度及其校准微球
精密度常规的实验要求CV值小于3%。
当使用荧光微球或生物活细胞评估仪器的精密度或进行质控时，样品能发出足够数量的光子。
可不考虑光子的统计学变异对荧光变异的影响。
对于特殊的一些实验，细胞周期和倍体分析时，均质性细胞间的CV%小于2%。
2．准确度及其校准
准确度不很重要，它受多种因素的干扰，尤其是非线性问题。
对于DNA定量分析，通常G2/S期的细胞其DNA含量应为G0/G1期细胞的2倍，但实测值只是略高甚至略低，其原因就在于仪器进行数据处理时采用的是脉冲高度值而不是脉冲面积积分，这就造成测定值与真实值之间的非线性。
内标或某些生物活细胞，对仪器准确度进行有效监测，如鸡或鱼的红细胞。
3．荧光补偿调整
补偿原因，当使用两种或以上的荧光素进行分析时，激光激发下的相邻或相近荧光素发出的荧光会产生交叉重叠，从而干扰检测结果，通过进行荧光补偿调整，可以保证每个检测器检测到恰当的单一荧光信号，即保证了结果可靠性。
补偿试剂有每种荧光素或相应的标记抗体对抗原表达量适中的细胞进行单染色和商品化荧光补偿试剂两种。
4．校准结果的记录和解析
当使用各种标准微球对仪器进行校正时，需要将微球测定结果绘制成质控图，常用Levey-Jennings质控图，观察质控结果是否超过控制限以决定失控与否。
（二）数据获取
数据获取，一，保证仪器处于最佳状态，获取数据前，首先采用各种标准微球对仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数进行校正和检验。
当仪器性能的校准参数均在允许范围内才能进行数据获取，进而通过同型对照或阴性对照设定检测阈值。
二，获取细胞量：10000～20000个细胞，对于抗原表达较少的靶细胞至少需要收集2000～3000个待测靶细胞。
三，获取数据的速度，对于细胞表型分析，200～400个细胞/秒；对于细胞周期和倍体分析，控制在100～200个细胞/秒 。
四，线性参数和对数参数的选择，前向散射光信号采用线性参数收集数据，侧向散射光和荧光信号采用对数参数收集数据，某些具体实验中，参数形式的选择需要重新调整，如在对微小粒子检测分析时（如血小板和内皮微粒），为提高检测灵敏度，前向散射光可采用对数参数收集数据，在PI染色进行细胞周期和倍体分析时，荧光信号通过线性形式收集可以清楚地区分各个周期时相。
五、室间质量评价
方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。
其主要。