大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质
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江 苏 无锡 ２４２ ） １ １ ２
摘 要 ：以大肠杆 菌基 因组 ＤＮＡ 为模 板 ， 扩增得到 苹果 酸脱 氢酶 （ ｈ 编码 基 因 ｍｄ ， ｍｄ ） ｈ 构建 了重
组 菌 ｐ Ｔ ２ ａｍｄ ／ Ｉ １并 成 功 表 达 了 ｍｄ ， 小 约 ３ ０ 。 选 用 Ｎｉ 亲 和 层 析 法 纯 化 具 有 活 Ｅ 一８— ｈ Ｂ ２ ｈ大 ６０ ０ 柱
酶 ， 由相 同或 相 似 亚 基组 成 的 二 聚体 或 四聚 体 ， 是 亚 基 的相 对 分 子 质 量 为 ３ ０ ～ ３ ０ ， 化 草 酰 ００ ０ ５０ ０ 催
嘌呤二核苷 酸 （ ＤＨ） 咪 唑 和卡 那 霉 素 ： 自上 ＮＡ ， 购
海 Ｓｎ ｏ ａ ｇ ｎ公 司 ； 烯 酰 胺 、 叉 双 丙 烯 酰 胺 ： 自 丙 甲 购
Ｉ ａ ｎ ｐｒ ｌｍ ｉ ａ ｙ ｔ ｙ， ｔ ｅ ｎ ｙ ａ ｉ ｐｒ ｐ ｒ ｉｓ ｆ ｔ ｐｕ ｉｉｄ Ｈ ｉ ａ ｇ ｄ ｅ ｙ ｅ ｗ ｅ ｅ ｅｉ ｎ ｒ ｓ ｕｄ ｈ ｅ ｚ ｍ ｔｃ ｏ ｅ ｔｅ ｏ ｈｅ ｒｆｅ ｓ ｔ ｇ ｅ ｎｚ ｍ ｒ ｃ ａ ａ ｔ ｒｚ ｄ Ｉ ａ ｏ ｄ ｔ ｖ ｈ ｒ ｃ ｅ ｉｅ ． ｔｗ ｓ ｆ ｕｎ ｏ ｈａ ｅ ｐＨ ｎｄ ｔ ｍ ｐ ｒ ｔ ｅ ｏ ｉ ａ ｏ ７ Ｃ ｎ ．０， ｒ ｓ ｅ ｔｖ ｌ ａ ｅ ｅ ａ ｕｒ ｐｔｍ ｆ３ ａ ｄ ６ ｅ ｐ ｃ ｉ ｅｙ． Ｔ ｈ ｎ ｙｍ ｅ ｗａ ｔ ｂｌ ｈｅ Ｈ ｎ ｅ ｐ ｒ ｔ ｅｋｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｎｇ ． ｏ ６ ０ ａ ｌ ｅｅ ｚ ｓ ｓａ ｅｗ ｎ ｐ ａ ｄ ｔ ｍ ｅ ａ ｕｒ ｐｔｉ ｈ ａ ｅｏｆ２ ０ ｔ ． ｎｄ ｂ ｏｗ ２ ℃ 。 ４ ｒ ｓ ｅ ｔｖ ｌ ． Ｉｓ ａ ｔｖ ｔ ｓａ ｔｖ ｔ ｄ ｂ ｅ ｐ ｃ ｉ ｅ ｙ ｔ ｃ ｉ ｉｙ ｗａ ｃ ｉ ａ ｅ ｙ Ｋ ｄｒ ｍ ａ ｉａ ｌ ａ ｔｃ ｌｙ，ｉ ｉ ｉｅ ｙ Ｃｕ 。ｓ ｒｏ ｌ ｎ ｂ ｔ ｄ ｎｈ ｂ ｔ ｄ ｂ ｅ ｉ ｕｓｙ ｉ ｈｉ ｉｅ
２ ａ（ ） ８ ＋ ．Ｔｈ ｅ ｕｌｅ ｅ ｏ ｂ ｎ ｎｔｐｌｓ ｄ ｗａ ｒ ｎｓｏｒ ｄ ｉ ｔ ｃ ｌ ｅ ｒ ｓ ｔ ｄ ｒ ｃ ｍ ｉ ａ ａ ｍｉ ｓ ｔａ ｆ ｍｅ ｎ ｏ Ｅ． ｏ ｉＢＩ２ｌ（ ＤＥ３） Ｉ ｄｕ ｅ ． ｎ ｃｄ
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应最适温度 为 ３ 在 ４ ７Ｃ， ２℃以下酶的稳定性较好 。Ｋ 对酶有 明显的激 活作 用， ｕ 对酶有抑 制作 Ｃ
用， ２ Ｈｇ 和 Ｚ 对 酶 有 很 强 的 抑 制 作 用 。醇 类 对 酶 的 活 力 影 响 不 大 ， 三 醇 可 显 著 提 高酶 的 热 稳 定 ｎ 丙 性 。酶 动 力 学 参数 以 草 酰 乙酸 为 底 物 的 Ｋ 为 ０ ２ ５ｍ ｌＬ ． ３ ｍｏ／ ， 关 键 词 ： 肠 杆 菌 ； 隆 表 达 ； 果 酸 脱 氢 酶 ； 化 ； 学 性 质 大 克 苹 纯 酶
ＬＩＱｉｎ ， ＸＵ ｅ ｊ ａ 。 ａ Ｍ ｉ ｎ ， —ｕ
ＸＩ Ｈａ—ｅ ｇ～， ＲＡＯ Ｚ ｉ ｉｇ¨・ Ａ ｉ ｎ ｆ ｈ ｎ ｍ
（ ．Ｋｅ ｂ ｒ ｔ ｒ ｆＩ ｄ ｓ ｒａ Ｂｉｔ ｃ ｎ ｌｇ ，Ｍ ｉ ｉｔ ｙｏ ｕ ａ ｉｎ， ｉｎ ｎ ｎ Ｕｎ ｖ ｒ ｉ １ ｙＬａ ｏ ａ ｏ ｙｏ ｎ ｕ ｔｉ ｌ ｏ ｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｎｓｒ ｆ Ｅｄ ｃ ｔｏ Ｊａ ｇ ａ ｉｅ ｓｔ ｙ，Ｗ ｕ ｉ １ ２ ，Ｃｈ ｎ ｘ ２ ４１ ２ ｉａ
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ｒ ｓ ｃ ｉ ｅ ｙ ｅ ｐｅ ｔｖ ｌ ．
第 ３ Ｏ卷 第 ２期 ２ｌ Ｏ １年 ３月
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｏ ｄ Ｓ ｉｎｃ ｎｄ Ｂｉ ｔｃ ｎ ｌ ｇ ｏ ｒ ａ ｆＦ ｏ ｃｅ ｅ ａ ｏ ｅ ｈ ｏ ｏ ｙ
Ｖｏｌ３ｏ ＮＯ． ＿ ２
Ｍ ａ． ｒ ２ ０１１
文 章 编 号 ：６ ３ １ ８ ２ １ ） ２０ ６ ６ ｌ ７ ６ ９（０ ０ — ２ ７０ １
酸 脱 氢 酶 在 临 床 诊 断 中 用 于 多 酶 分 析 及 疾 病 的 早 期 诊 断 ， 如 用 于 诊 断 Ｄ Ｃ 弥 散 性 血 管 内 凝 血 ） 心 例 Ｉ（ ，
收 稿 日期 ： Ｏ ＯＯ ２ ２ １ ６ ２ 基 金 项 目 ： 家 ８ ３计 划项 目（ ０ ６ 国 ６ ２ ０ ＡＡ０ ０ ０ ，２ ０ ＡＡ０ Ｚ ０ ） 国 家 自然 科 学 基 金 项 目（２ ６ ６ ５ ２１３ ０７ ２ ２７； ０ ７ ０ ３，３ ９ ０ ５ ） ０ ７０ ６ ；
（ Ｅ３） Ａｎ ｃｉ ｅ Ｄ ． ａ ｔｖ Ｍ Ｄ Ｈ ｗ ａ ｐ ｉｉｄ ｙ ｓ ｕｒｆｅ ｂ Ｎ ｉＮ Ｔ Ａ ｏ ｕｍ ｎ ｆｉ ｉｙ — ｃｌ ａ ｆｎ ｔ Ｃｈｒ ｍ ａ ｏ ｒ ｐｈ ｏ ｔ ｇ ａ ｙ， ｗｉｈ ｈ ｔ ｔ ｅ
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性 的 苹 果 酸 脱 氢 酶 （ ｈ ， 化 后 比 酶 活 达 到 １ ２ ５ Ｕ／ ｍｄ ） 纯 １ ． ｍｇ， 化 倍 数 达 ２ ６ 纯 ． ２倍 ， 收 率 为 ５ 。 回 ９
并 对 该 酶 的 酶 学性 质进 行 了初 步研 究 ， 中反 应 最 适 ｐ 值 为 ６０ 在 ｐ 值 ２ ０ ． 其 Ｈ ．， Ｈ ． ４６ ０范 围 内稳 定 ； 反
中 央高 校 基 本科 研 业 务 费 专 项 资金 项 目 （ＵＳ Ｐ １ ０ ） Ｊ Ｒ ３０１。
＊通 信 作 者 ：饶 志 明 （ ９ ５ ） 男 ， 西 抚 州 人 ， 学 博 士 ， 授 ， 士 研 究 生 导 师 ， 萤 从 事 微 生 物 育 种 与 发 酵 工 １７ 一 ． 江 农 教 博 主
可 以 ＮＡＤ 或 ＮＡＤＨ 为 辅 因 子 。
其他 试剂均为 国产 分析 纯试剂 。
１ ２ 方 法 ．
苹果 酸脱氢酶 不仅是 一 种重 要 的糖 代谢 酶 ， 而
１ ２ １ 苹 果 酸 脱 氢 酶 基 因 ｍｄ ． ． ｈ的 克 隆
பைடு நூலகம்
根 据 ＮＣ —
且 具有较 高 医学 诊 断价 值 和 理论 研 究 价 值 。苹 果
Ｋｅ ｗｏ ｄｓ Ｅｓ ｈ ｒ ｃ ｉ ｃ ｌ ， ｃｏｎ ｎ ａ ｄ ｅ ｒ ｓ ｉｎ， ｍａ ａ ｅ ｄｅ ｄ ｏ ｎａ ｅ （Ｍ ＤＨ ）， ｙ ｒ ： ｃ ｅ ｉｈ ａ ｏ ｉ ｌ ｉｇ ｎ ｘｐ ｅ ｓｏ ｌ ｔ ｈｙ ｒ ｇｅ ｓ
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程 方 面 的研 究 。Ｅ ｉ：ａ ｚ ｍａｌｒｏｍ＠ ｙ ｈ ｏ ｃ ｒ． ｎ ａ ｏ ． ｏＩ ｃ １
２８ ６
ｂｙ Ｚｎ
食 品 与 生 物
技 术 学 报
第３ ０卷
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中 图分 类 号 ： ８ ４ Ｑ １ 文 献 标 识 码 ：Ａ
为 ０４ ｘ ｌ（ ｒｉ 。 ．７／ ／ Ｌ・ ｎ ｍｏ ａ ）
Ｃｌ ｎ ｎｇ，Ｅｘ ｒ ｓ ｉ ｎ，ａ ｄ Ｃｈａ ａ ｔ ｒｚ ｔｏ ｆａ Ｍ ａ ａ ｅ １ｅ ｙ ｒ ｇ ｎａ ｅ ｏ ｉ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ｒ ｃ ｅ ｉａ ｉ ｎ ｏ ｌ ｔ ） ｈ ｄ ０ ｅ ｓ Ｇｅ ｅ ｆ ｏ Ｅｓ ｈ ｒ ｃ ａ ｃ ｌ ｎ ｒ ｍ ｃ ｅ ｉ ｈｉ ｏ ｉ
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海赛 百盛基 因技 术有 限公 司合成 ；广范 围蛋 白质相
对 分 子 质 量 标 准 ： 自 Ｆ ｒ ｎａ 和 Ｔａ ａａ 司 ； 购 ｅｍｅ ｔｓ ｋｒ 公
乙酸盐 与苹果酸盐 进 行相 互转 化 时 ， 苹果 酸脱 氢 酶
大肠 杆 菌 苹果 酸脱 氢酶 基 因 ｍｄ ｈ的克隆 、 高效 表 达及 酶 学性质
李 倩 ， 徐 美娟 。 夏 海锋 ， 饶 志明 叫 ， 。
（ ．江 南 大 学 工 业 生 物技 术 教 育 部 重 点 实 验 室 ， 苏 无 锡 ２ ４ ２ ；２ 江 南 大 学 生 物 工 程 学 院 ， １ 江 １１２ ．
苹 果 酸 脱 氢 酶 （ Ｃ １ １ １ ３ ， ｈ 广 泛 分 布 Ｅ ． ． ． ７ ｍｄ ）
公 司 ； ｉ、 Ｄ ： 自 Ｓｇ Ｔｒ Ｓ Ｓ 购 ｓ ｉｍａ公 司 ；还 原 型 酰 胺 腺
在动物组 织 、 生物 和植 物 中口 。它 是 一种 活性 较 微 强 的酶 ， 存在 于 乙醛 酸体 、 粒 体 、 氧 化 物 体 、 线 过 叶 绿体 、 细胞浆 、 以及 锥 虫 甘 油体 内。ｍ ｈ为多 聚 体 ｄ
摘 要 ：以大肠杆 菌基 因组 ＤＮＡ 为模 板 ， 扩增得到 苹果 酸脱 氢酶 （ ｈ 编码 基 因 ｍｄ ， ｍｄ ） ｈ 构建 了重
组 菌 ｐ Ｔ ２ ａｍｄ ／ Ｉ １并 成 功 表 达 了 ｍｄ ， 小 约 ３ ０ 。 选 用 Ｎｉ 亲 和 层 析 法 纯 化 具 有 活 Ｅ 一８— ｈ Ｂ ２ ｈ大 ６０ ０ 柱
酶 ， 由相 同或 相 似 亚 基组 成 的 二 聚体 或 四聚 体 ， 是 亚 基 的相 对 分 子 质 量 为 ３ ０ ～ ３ ０ ， 化 草 酰 ００ ０ ５０ ０ 催
嘌呤二核苷 酸 （ ＤＨ） 咪 唑 和卡 那 霉 素 ： 自上 ＮＡ ， 购
海 Ｓｎ ｏ ａ ｇ ｎ公 司 ； 烯 酰 胺 、 叉 双 丙 烯 酰 胺 ： 自 丙 甲 购
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应最适温度 为 ３ 在 ４ ７Ｃ， ２℃以下酶的稳定性较好 。Ｋ 对酶有 明显的激 活作 用， ｕ 对酶有抑 制作 Ｃ
用， ２ Ｈｇ 和 Ｚ 对 酶 有 很 强 的 抑 制 作 用 。醇 类 对 酶 的 活 力 影 响 不 大 ， 三 醇 可 显 著 提 高酶 的 热 稳 定 ｎ 丙 性 。酶 动 力 学 参数 以 草 酰 乙酸 为 底 物 的 Ｋ 为 ０ ２ ５ｍ ｌＬ ． ３ ｍｏ／ ， 关 键 词 ： 肠 杆 菌 ； 隆 表 达 ； 果 酸 脱 氢 酶 ； 化 ； 学 性 质 大 克 苹 纯 酶
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食 品 与 生 物 技 术 学 报
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文 章 编 号 ：６ ３ １ ８ ２ １ ） ２０ ６ ６ ｌ ７ ６ ９（０ ０ — ２ ７０ １
酸 脱 氢 酶 在 临 床 诊 断 中 用 于 多 酶 分 析 及 疾 病 的 早 期 诊 断 ， 如 用 于 诊 断 Ｄ Ｃ 弥 散 性 血 管 内 凝 血 ） 心 例 Ｉ（ ，
收 稿 日期 ： Ｏ ＯＯ ２ ２ １ ６ ２ 基 金 项 目 ： 家 ８ ３计 划项 目（ ０ ６ 国 ６ ２ ０ ＡＡ０ ０ ０ ，２ ０ ＡＡ０ Ｚ ０ ） 国 家 自然 科 学 基 金 项 目（２ ６ ６ ５ ２１３ ０７ ２ ２７； ０ ７ ０ ３，３ ９ ０ ５ ） ０ ７０ ６ ；
（ Ｅ３） Ａｎ ｃｉ ｅ Ｄ ． ａ ｔｖ Ｍ Ｄ Ｈ ｗ ａ ｐ ｉｉｄ ｙ ｓ ｕｒｆｅ ｂ Ｎ ｉＮ Ｔ Ａ ｏ ｕｍ ｎ ｆｉ ｉｙ — ｃｌ ａ ｆｎ ｔ Ｃｈｒ ｍ ａ ｏ ｒ ｐｈ ｏ ｔ ｇ ａ ｙ， ｗｉｈ ｈ ｔ ｔ ｅ
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性 的 苹 果 酸 脱 氢 酶 （ ｈ ， 化 后 比 酶 活 达 到 １ ２ ５ Ｕ／ ｍｄ ） 纯 １ ． ｍｇ， 化 倍 数 达 ２ ６ 纯 ． ２倍 ， 收 率 为 ５ 。 回 ９
并 对 该 酶 的 酶 学性 质进 行 了初 步研 究 ， 中反 应 最 适 ｐ 值 为 ６０ 在 ｐ 值 ２ ０ ． 其 Ｈ ．， Ｈ ． ４６ ０范 围 内稳 定 ； 反
中 央高 校 基 本科 研 业 务 费 专 项 资金 项 目 （ＵＳ Ｐ １ ０ ） Ｊ Ｒ ３０１。
＊通 信 作 者 ：饶 志 明 （ ９ ５ ） 男 ， 西 抚 州 人 ， 学 博 士 ， 授 ， 士 研 究 生 导 师 ， 萤 从 事 微 生 物 育 种 与 发 酵 工 １７ 一 ． 江 农 教 博 主
可 以 ＮＡＤ 或 ＮＡＤＨ 为 辅 因 子 。
其他 试剂均为 国产 分析 纯试剂 。
１ ２ 方 法 ．
苹果 酸脱氢酶 不仅是 一 种重 要 的糖 代谢 酶 ， 而
１ ２ １ 苹 果 酸 脱 氢 酶 基 因 ｍｄ ． ． ｈ的 克 隆
பைடு நூலகம்
根 据 ＮＣ —
且 具有较 高 医学 诊 断价 值 和 理论 研 究 价 值 。苹 果
Ｋｅ ｗｏ ｄｓ Ｅｓ ｈ ｒ ｃ ｉ ｃ ｌ ， ｃｏｎ ｎ ａ ｄ ｅ ｒ ｓ ｉｎ， ｍａ ａ ｅ ｄｅ ｄ ｏ ｎａ ｅ （Ｍ ＤＨ ）， ｙ ｒ ： ｃ ｅ ｉｈ ａ ｏ ｉ ｌ ｉｇ ｎ ｘｐ ｅ ｓｏ ｌ ｔ ｈｙ ｒ ｇｅ ｓ
ｐｕ ｉｉａ ｉ ｒｆｃ ｔｏｎ， ｅ ｙ ａ ｉ ｒ ｐ ｒｉ ｓ ｎｚ ｍ ｔｃｐ ｏ ｅ ｔｅ
程 方 面 的研 究 。Ｅ ｉ：ａ ｚ ｍａｌｒｏｍ＠ ｙ ｈ ｏ ｃ ｒ． ｎ ａ ｏ ． ｏＩ ｃ １
２８ ６
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食 品 与 生 物
技 术 学 报
第３ ０卷
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中 图分 类 号 ： ８ ４ Ｑ １ 文 献 标 识 码 ：Ａ
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海赛 百盛基 因技 术有 限公 司合成 ；广范 围蛋 白质相
对 分 子 质 量 标 准 ： 自 Ｆ ｒ ｎａ 和 Ｔａ ａａ 司 ； 购 ｅｍｅ ｔｓ ｋｒ 公
乙酸盐 与苹果酸盐 进 行相 互转 化 时 ， 苹果 酸脱 氢 酶
大肠 杆 菌 苹果 酸脱 氢酶 基 因 ｍｄ ｈ的克隆 、 高效 表 达及 酶 学性质
李 倩 ， 徐 美娟 。 夏 海锋 ， 饶 志明 叫 ， 。
（ ．江 南 大 学 工 业 生 物技 术 教 育 部 重 点 实 验 室 ， 苏 无 锡 ２ ４ ２ ；２ 江 南 大 学 生 物 工 程 学 院 ， １ 江 １１２ ．
苹 果 酸 脱 氢 酶 （ Ｃ １ １ １ ３ ， ｈ 广 泛 分 布 Ｅ ． ． ． ７ ｍｄ ）
公 司 ； ｉ、 Ｄ ： 自 Ｓｇ Ｔｒ Ｓ Ｓ 购 ｓ ｉｍａ公 司 ；还 原 型 酰 胺 腺
在动物组 织 、 生物 和植 物 中口 。它 是 一种 活性 较 微 强 的酶 ， 存在 于 乙醛 酸体 、 粒 体 、 氧 化 物 体 、 线 过 叶 绿体 、 细胞浆 、 以及 锥 虫 甘 油体 内。ｍ ｈ为多 聚 体 ｄ