第六章：以大肠杆菌为宿主的克隆载体

质粒载体的基因和物理图分析
（以pBR322为例）
6.1.2
6.1.2 pBR322的优点：
• 1、具有较小的相对分子质量：只有4363bp（一个克 隆载体的大小应该小于10kb）。
• 2、两个抗生素抗性选择标记基因（ampR和TetR）， 而且每个抗性基因内都有限制性单酶切位点，可导致 抗性基因插入失活。
6.2
6.2 基于M13 噬菌体的克隆载体
噬菌体的DNA分子携带较多的复制必须的 基因，包括噬菌体蛋白质衣壳组成部分和噬菌 体专性复制酶的基因。如果这些基因中的任何 一个改变或缺失，就防碍或破坏噬菌体DNA分 子的复制能力。因此，噬菌体的DNA分子可被 改变的余地就很小（噬菌体克隆载体一般与原 始的噬菌体分子的区别就很小）。
其它pUC系列质粒：pUC18和pUC19
同pUC8类似，pUC18和pUC19也来自于pBR322，优点： • ColE1复制起点，松弛性，高拷贝，Rop基因（控制拷贝数
的基因）突变，松弛性更强。 • Amp(R) • 在MCS（多克隆位点）处，pUC18和pUC19具有更多种类
的常用内切酶位点。 • －互补（在MCS中插入外源片段后，可通过—互补作用
3)、 pBR322的拷贝数很多
一般，在一个转化的E.coli细胞中有大约15个质 粒DNA分子，这个数目可以通过使用一种蛋白质 合成抑制物，如氯霉素（chloramphenicol）而 增加到1000-3000个。因此，一次E.coli培养就 可提供大量的重组pBR322分子。
6.1.3
6.1.3 pBR322的家谱：
在总的拷贝数上前两者为30-45个分子。这个特性对质粒产量没 有多大意义，因为对所有这三种质粒来说，通过扩增其拷贝数可 提高到1000个。在正常细胞中的较高的拷贝数利于在实验室中研 究克隆基因的功能。这种情况下，基因量（gendosis）很重要， 因为拷贝数越高，实验中克隆基因对宿主细胞的影响作用越容易 观察到。对此类研究，pAT153和pBR327就比pBR322更合适。 • 在pAT153和pBR327中pBR322的连接特性被破坏了。
6.1.1 质粒克隆载体的命名
• pBR322这个名字符合载体命名法的标准规则。 • —“p” plasmid的首字母，说明是一个质粒。 • —“BR”指组建这个质粒的实验室（ BR代表了两
个构建人的名字：Bolivar和Rodriguez）。 • —“322”是将该质粒与同一个实验室中发展的其
它质粒区分开的编号（比如还有pBR325， pBR327，pBR328等）。
pUC8具有两个优点：
• 首先，可以将含有重组pUC8分子的E.coli细胞在含氨 苄青霉素和X-Gal的琼脂糖板上只需一步就可识别出来。 如果用介绍过的其它载体则需要两个步骤：例如，如 果用pBR322，就必须将复制板从一个含抗生素的基质 转到含另一种抗生素的基质上。找出在新的基质上不
生长的对应的菌落即是含有重组质粒的菌落。
• 第二个优点就是它众多的限制性酶切点，在具体操作
中，我们可以用两个具有不同限制性内切酶酶切末端 的DNA-片段进行克隆（如EcoRI和BamHI末端），进 行DNA-片段克隆时灵活性更大。 • 另外，这个载体中的酶切点的集中位点与相应的 M13mp载体系列的位置相同。在pUC8中克隆DNA， 也可以直接导入M13mp8，并以这种形式通过测序和 体外突变进行分析。
2)、两个抗生素抗性基因
pBR322的第二个特征是它携带氨苄青霉素和四环素两个抗生素抗 性基因。我们可以利用氨苄青霉素或四环素作为含有这种质粒的 细胞标记。在这两个基因里，只要有一个限制性酶切位点，就可 以被克隆实验所用。实际上在pBR322质粒载体中的两个抗生素 抗性基因编码区存在许多限制性内切酶位点: PstI、PvuI和ScaI 位于氨苄青霉素编码区，Sal I、 Eag I 、BamHI和HindIII等则 位于四环素编码区，将pBR322用限制性内切酶PstI、PvuI或 ScaI切开后，加入一个新的DNA-片段，ampR基因就失去活性。 如果我们用位于TetR抗性基因编码区中存在的任一种限制性内切 酶（特别是BamHI或HindIII）处理，对四环素的抗性也就消失。 这样，许多不同的限制性位点可用作DNA-片段插入位置，根据 抗性基因失活进行筛选；并且，还可以在pBR322中克隆具有各 种不同粘性末端（8种酶中的任一种）的DNA-片段。
• 3、相当高的拷贝数：通常在被转化的E.coli中有大约 15个pBR322质粒分子，而且在氯霉素存在下，经过 扩增每个细胞中拷贝数可达1000-3000个。
1)、 pBR322的大小
pBR322长4363bp，一般情况下，一个克隆载 体的长度应小于10kb，才能在纯化过程中不会 断裂。长度为4363bp的pBR322有利于我们很 容易地分离它，而且用它组建的重组DNA-分 子也容易分离。即使要插入的DNA 有6kb长， 这个重组的pBR322分子也在允许的范围之内。
pBR322由3个在自然界存在的天然质粒拼接而成。
• R1（ampR）：抗生素耐药性质粒R1， • R6-5（TetR）：抗生素耐药性质粒R6-5， • pMB1（复制起点）：ColE1菌株中生产大肠杆
菌素的质粒。 • pBR322的详细建造过程见图6-2a。
6.1.4
6.1.4 其他典型的大肠杆菌 质粒克隆载体
正常的M13基因组为6.4kb长，仅10个相邻 的基因就占了大部分（图6-6），这些基因对噬 菌体的复制是必不可少的，不能被破坏。M13 只在一个507个核苷酸长的序列中可以插入新的 DNA，并且在这个区域里，还有一个复制起点 （ori），它本身也必须完整存在不能被破坏。 因此，改变M13基因组的可能性是有限的。
（3）酵母人工染色体载体（YAC） （4）细菌人工染色体载体（BAC） （5）其他载体
在细菌质粒、细菌噬菌体载体、细菌人工染色体载体（BAC） 中，有许多是以大肠杆菌为宿主（寄主或受体）的载体。 如：细菌质粒中的：1、pBR322、 2、pBR325、pBR327
3、pUC质粒、4、pGEM3Z、5、pCAMBIA1391、 pCAMBIA1300 细菌噬菌体载体中的：
第六章 大肠杆菌的克隆载体
---以 E.coli 作为宿主（受体）的克隆载体
第二章中我们已经介绍了 克隆载体的种类及特性：
（1）质粒（plasmid）载体（又可分为：克隆载体、 中间载体、穿梭载体和表达载体）
（2）噬菌体（phage）载体 A、λ —噬菌体 B、考斯质粒（粘性质粒）（cosmid) C、M13—DNA（单链丝状噬菌体）
6.1.1 质粒克隆载体的命名 6.1.2 pBR322的优点 6.1.3 pBR322的家谱 6.1.4 其他典型的大肠杆菌质粒克隆载体
6.2 基于M13 噬菌体的克隆载体
6.2.1 M13mp2克隆载体的构建 6.2.2 M13mp7 ---另一种具有对称的克隆位点的简单的克隆载体 6.2.3 其它M13系列载体 6.2.4 质粒和M13的杂交载体
形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒） • 小分子质粒（小于3000bp)
pUC18和pUC19是最常用的质粒载体，几乎未含多余的DNA 片段。
重要的大肠杆菌质粒载体：pUC18/pUC19
拷贝数：500-2000 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序
pGEM3Z载体
pAT153和pBR327成为非接合性质粒，不能转移到其它的 E.coli细胞中。这对生物的安全有意义，这一特性可避免重组的 pAT153和pBR327分子从试管中泄漏，而侵入到工作马虎的分子 生物学工作者的肠道菌群里去。与此相反，pBR322理论上可以 通过连接转移到E.coli的自然种群里，实际上，这种质粒也具有 保护功能，使这种转移过程成为不可能。因此如果某个克隆基因 在发生事故时会有危险，还是最好使用pAT153和pBR327。
pBR325
pBR325 具有三个可选择的标记
• pBR325很明显地是一个具有附加DNA-片段的 pBR322质粒，这个片段含有一个氯霉素-乙酰转移酶 （CAT），它可以使氯霉素失活，使质粒具有抗氯霉 素抗性。在这个质粒中CAT-基因中有唯一的一个 EcoRI切点。如果用这个切点进行克隆，就可根据对 氯霉素抗性的丧失来识别重组体。
在pBR322基础上切掉了705bp
(3273bp)
在pBR322基础上切掉了1089 bp
百度文库 pUC8
• pUC8可依靠LacZ`-基因通过蓝白斑辅助筛选。 • pUC8来自pBR322，仅保留了其复制起点和
ampR基因。并且这个抗性基因的核苷酸序列也 发生了改变：原来抗性基因里的限制性内切酶位 点已不存在。在pUC8里这些酶切位点都集中于 LacZ`基因的序列中。
6.3 λ-细菌噬菌体克隆载体
6.3.1 λ细菌噬菌体基因组结构分析 6.3.2 通过自然选择可以分离出缺少一定的限制性位点的λ-噬菌体 6.3.3 插入载体（insertion）和置换载体（substitution vector） 6.3.4 使用λ-插入载体或者置换载体进行的克隆实验 6.3.5 柯斯质粒载体(cosmid vectors) 6.3.6 用λ-载体进行基因文库筛选
到新的选择标记或者附加限制性位点。组建这两个 质粒时，pBR322的一大段被切去，在pAT153里 切掉了705bp，而在pBR327则切掉了1089 bp。 ampR和tetR则完整保留着。但质粒的复制特征和 连接特征发生了变化。
pAT153、pBR327与pBR322的区别：
pAT153和pBR327与pBR322有两方面的区别： • pAT153和pBR327的拷贝数都多于pBR322
• 与pBR322相比，pBR325有两个优点： 1）多了一个用于克隆的限制性识别位点（pBR322也有一
个EcoRI切点，但它既不在ampR,也不在tetR基因里） 2）第三个用作选择标记的抗生素抗性基因。
pAT153和pBR327
• pAT153和pBR327都是多拷贝质粒 • 这两种质粒均来自pBR322，在构建时，并非关系
6.1 以大肠杆菌质粒为基础的质粒克隆载体
• DNA克隆中使用最多的、最简单的克隆载体是由小 的细菌质粒演化来的。
• 利用E.coli作为宿主的质粒载体种类很多。 • 它们具有许多有用的特性：容易提取、转化效率高、
携带筛选标记（转化体和重组体） ，还可用它来克 隆很大的DNA-片段（达8kb）。这样的载体在大多 数常规克隆实验中都会使用。 • pBR322是最早被构建至今仍被广泛使用的载体。
pGEM3Z载体也含有ampR 和lacZ基因,并且在lacZ基因内 部有一个限制性内切酶位点，此外pGEM3Z载体中限制性 内切酶位点两边还多了两个短片段，每一个片段都可充当 启动子，可附着RNA聚合酶进行转录。外源DNA在限制 性内切酶位点被导入pGEM3Z载体后，重组后的pGEM3Z 质粒和提纯的RNA聚合酶在试管中可实现RNA的转录。 pGEM3Z质粒携带的启动子并不是被大肠杆菌RNA聚合酶 识别的标准启动子，而是被T7噬菌体编码的RNA聚合酶 及SP6噬菌体编码的RNA聚合酶专一识别，因此体外RNA 合成系统选择的是病毒RNA聚合酶。
大肠杆菌质粒克隆载体很多，并且，许多大肠杆菌质 粒克隆载体都与pBR322的特性和用途非常相似。我们 重点介绍由pBR322改造来的四个载体：pBR325 、 pAT153和pBR327、pUC8 。这些载体中，每个载体 都有一个附加的特征，使它们在一定的克隆实验中比 原来的质粒具有更明显的优点。
质 粒 图 谱
λ噬菌体载体（lambda phage vector) 丝状噬菌体：M13等 本章将列举几个具有代表性的以大肠杆菌为宿主的载体，详细介 绍大肠杆菌的克隆载体（pBR-和pUC-系列，M13和λ—噬菌体 载体）的结构、特征、来源、命名以及这些载体的特殊用途。
6.1 以大肠杆菌质粒为基础的质粒克隆载体