3分子克隆载体

顺式作用元件指的是在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序 列，常不编码蛋白质合成。 反式作用因子则指的是对不同核酸链上的基因表达起到调控作用的 蛋白，编码该蛋白的基因与其识别结合作用的核酸链不是同一链。 顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言 为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式” （trans）。
（3）连接产物的电转化 ①大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备：( 见分子克隆指南第 三版 )
②电转化:取100mL菌悬液于一个0.2cm的电击杯(Bio-Rad产 品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA（一般3～5mL），混匀 后在冰浴上放置10－20min，用Genepulser TM型电脉冲仪(BioRad产品) 进行电脉冲。电脉冲参数选定为：脉冲场强V =9.0 kV/cm，电容C =25 m F，阻抗 R =200Ω，脉冲时间G =4.0～ 4.8ms。电脉冲完毕后，加入0.8mLSOC培养液于电转化杯中， 并在37℃以150r/min恢复培养2h后，涂布氯霉素抗性平板，置 37℃d Ⅲ与Not Ⅰ酶切
（3）电洗脱（透析） 首先将脉冲电泳后50kb左右的条带切胶，把此条胶装入煮过 的灌满1×TAE（50×TAE母液：2mol/L Tr is×HCl，pH8.0 ， 1mol/L乙酸，100 mM/LEDTA）缓冲液的透析袋中，将缓冲液 尽量倒净，进行透析电泳，电泳参数为120v电压，电泳2－2.5h 后反向电泳30－40s。将透析袋轻轻揉搓下，吸出透析后的50kb 左右的外源 DNA 。
(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin, ampr） 使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌 中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的 酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌 进入细菌的周质区，催化 β-内酰胺环水解，从 而解除了氨苄青霉素的毒性。
2. pBeloBAC11 载体的制备
（1）载体DNA的提取 碱裂解法大量制备(见分子克隆指南第三版) （2）载体DNA的酶切 采用TakaRa公司的限制性内切酶Hin d Ⅲ对所抽提的载体 DNA进行酶切消化。酶的用量控制在100μL 体系30个单位的酶。 酶切体系：100μL，5μL 载体DNA，10μL10× buffer，2μL Hin d Ⅲ，88μL水，37 ℃，酶切2－3h。酶切结束后，65℃水浴处 理15min 完全灭活内切酶活性。 （3）酶切后载体DNA的去磷酸化 采用TakaRa公司的去磷酸化酶（CIAP）对酶切后的载体 DNA进行去磷酸化。37 ℃，作用1－1.5h 。
（2）脉冲电泳 采用Bio-Rad公司的CHEFⅢ型号的脉冲电泳仪和Middle Range Marker。电泳参数：起始脉冲转换时间1，终止脉冲转换 时间25，电泳时间18h，电压6.0v/cm，转角 120°，电泳缓冲 液为 0.5 × TBE（5×TBE母液：445 mM/L Tr i s × HCl，pH 8.0，445 mM/L硼酸，10 mM/L EDTA。电泳凝胶为1％。电泳 温度：14 ℃
3. 外源与载体的连接与转化
（1）外源与载体的连接 将制备好的50kb左右的外源与载体进行连接，Promega公司的 T4-DNA连接酶，连接体系：载体与外源的比例分别为1:8 ，连 接过夜。 （2）终止连接并对连接产物进行脱盐 65℃水浴处理15min终止连接反应；脱盐：首先制备终浓度为 0.1M的葡萄糖和1％琼脂糖的凝胶，取800μL热的凝胶于 1.5mL 的Appendorf管中，并于胶上放一PCR管，待胶凝之后拔掉PCR 管，则凝胶上出现的凹陷可以进行脱盐。将终止连接的反应物 置于凹陷处脱盐1h。
（4）自连后载体DNA的回收 将去磷酸化后的载体1：1加入苯酚：氯仿：异戊醇（25 ： 24 ：1 ，v/v/v ）抽提，取上层液体加两倍体积的无水乙醇沉 淀，离心 12000r/min，3min 。再用 70 ％的乙醇洗离心得到的 DNA ，干燥后加入TE溶解。将溶解的载体DNA用 Promega 公 司的 T4-DNA 连接酶进行自连，16 ℃，过夜。电泳回收7.6 kb 左右的条带，用V-gene公司的凝胶回收试剂盒凝胶回收。 （5）载体DNA浓度估测及分装保存 与单酶切的λ-Hin d Ⅲ的marker进行浓度对比，估测其浓度， 一般10ng/uL的载体与100ng/uL的外源相连接的效果较好。
1. 外源DNA的制备
(1) 制备 YBT-1520 菌株总 DNA 的包埋块 挑取单菌落于5mL LB液体培养基的摇瓶中，置30 ℃摇床过夜活化。1/100量的 转接于100mL LB液体培养基中。放置于30 ℃摇床培养至对数期。离心收集菌体， 8000r/m i n ，3min。弃上清，STE（ 0.1M NaCl ， 10mM Tr i s × HCl ，pH 8.0 ， 1mM EDTA）洗涤菌体。1.5mL TE25S(0.3M 蔗糖，25mM EDTA，25mM Tr i s × HCl ，pH 8.0) 重悬离心后的菌体。 50 ℃水浴中预热 TE25S 重悬的菌体，使其与 2 ％的凝胶1 ： 1混合。将上述混合液点于事先封好的制包埋块的模具中，待胶 凝固后将包埋块铲出。加5mLTE25S于离心管中，同时加入终浓度 2mg/mL的溶 菌酶，4 ℃冰箱过夜。用NDS （ 45mM EDTA ， 10mM Tris，1 ％十二烷基肌氨 酸钠）洗包埋块，加入 5mL NDS ，再加入终浓度 2mg/mL 的蛋白酶K，置于50 ℃水浴锅中水浴 24h。用T 10 E 10（10mM EDTA ，10mM Tr i s × HCl，pH 8.0） 润洗一遍包埋块，加入终浓度 0.1mmol/L的 PMSF( 蛋白酶抑制剂)，室温放置1h。 T 10 E 10 润洗包埋块 2 次，每隔 1h 一次。TE（10mM Tr i s × HCl，pH 8.0， 1mM EDTA ）润洗包埋块2次，每隔1h 一次。对包埋块进行预酶切，预酶切体系 为500μL ，加入450μL去离子水和 50 μL十倍的M buffer ，置冰上30min 。对包埋 块进行酶切，酶切体系为 500μL ，加入 445μL 去离子水，50 μL M buffer，5μL Hin d Ⅲ，在冰上放置20－30min ，置于 37 ℃水浴锅酶切2－4h。将酶切液体吸 净，将每个离心管中加入200μL载体和外源 DNA 片段经过酶切以后，外源 DNA 片段 插入到载体的适当位置，或置换载体的填充片段； 2、通过提取 Lambda 噬菌体的蛋白质外壳，可在体外将重 组噬菌体 DNA 进行包装，形成噬菌体颗粒； 3、这样的噬菌体颗粒保留对大肠杆菌的感染能力，可将被 包装的重组噬菌体 DNA 注射到宿主菌中； 4、通过裂解生长，可增殖重组噬菌体 。