KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达

KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达

1 引言

角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10， FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。

1.1 KGF-2的来源和基因结构

KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。

1.2 KGF-2的功能

KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于组

织的重塑

[3]。KGF-2有两种细胞膜表面受体：FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb。KGF-2与FGFR2Ⅲb的亲和力高，是其特异性配体。KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的Ｃ端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能[4,5]。在脊椎动物器官形态发生过程中， KGF-2 在间充质-上皮相互作用中十分关键，如在四肢形成过程中，KGF-2在侧板中胚层的有限区域表达，它诱导尖外胚层嵴细胞的分化，刺激细胞增殖导致肢芽形成[6]。脊椎动物器官的分支状形态发生也与FGFs家族相关，研究表明在小鼠肺的发育过程中，KGF-2可能是一个十分关键的生长因子和趋化物质[7]。其它经历分支状发生的器官，像泪腺和胰腺，KGF-2在其发育过程中也发挥一定作用[8,9]。另外，KGF-2几乎参与颅面区所有的结构发育，无论是早期的形成过程，还是后期的生长调节，KGF-2/KGFR2b 信号通路都是十分关键的[10]。在生殖系统的发育过程中，KGF-2 也起着重要的作用。在前列腺的发育过程中，间充质通过分泌KGF-2 等细胞因子来诱导前列腺上皮细胞发育。Donjacour等研究 FGF-10雄性小鼠模型时发现，大多数这种小鼠出生时雄性第二性器官缺失或萎缩，包括前列腺、精囊、尿道球腺和尾部输精管[9]。另外，Yucel等利用基因敲除小鼠模型证实，KGF-2 等生长因子在生殖结节的正常发育过程中协同其他细胞因子起着非常重要的作用[10]。这些研究结果说明 KGF-2可能在前列腺和其他附属性器官发育中起十分重要的作用。目前已经发现KGF-2在脊椎动物四肢、牙齿和毛发（羽毛），以及肺、耳、盲肠、颌下腺、胰腺和前列腺等器官的形成过程中起着极为重要的作用[11]。KGF-2也有辐射防护作用[12]。 KGF-2可以提高辐射后小鼠的肠干细胞的存活率，并对辐射引起的气道上皮细胞的通透性升高具有拮抗作用。Knan等人应用离子微集落刺激法发现，KGF能显著降低辐射引起的肠道损伤。Waters和Savla 等人用测定荧光素异硫氰酸盐标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的外渗来反应培养的Calu-3和16HBE140单层细胞的通透性，结果发现在同等剂量的辐照条件，KGF（50ng/ml）预处理的培养单层细胞对FITC-BSA的通透性明显下降，而KGF对未辐射过的单层细胞的通透性无影响。通过激活蛋白激酶C（PKC），KGF可以加速辐射诱导的DNA损伤修复，并维持细胞骨架蛋白F-肌纤蛋白的稳定和保护细胞间连接。

1.3 Kgf-2在大肠杆菌中的表达优势

近年来的研究发现kgf-2基因在毕赤酵母中表达时，目的产物容易遭受宿主蛋白酶的降解[13]。大肠杆菌表达系统具有容易操作、能高效表达的特点，而且就重组蛋白的生物学活性而言，两种方式表达的重组蛋白均具有类似天然蛋白的生物学功能，其刺激NIH/3T3细胞增殖能力也几乎相当。因此本研究希望利用大肠杆菌表达系统来实现该基因的高效稳定表达。

2 主要仪器及原料

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

BL21菌株由军事医学科学院馈赠

2.1.2 寡核苷酸引物

实验所需引物由上海生工公司合成

pet28kgf(+)：CGGAATTCGGTCAAGACATGGTGTCACC

pet28kgf(-)：CGCTCGAGTTATGAGTGTACCACCATTGGA

2.1.3 试剂

PCR反应体系：dNTP溶液，Taq酶，XhoⅠ，Mg2+溶液

DNA电泳体系：琼脂糖，MarkerⅢ，6×loading Buffer ，TAE 缓冲液，Goldview

蛋白电泳体系：10%过硫酸铵，TEMED，巯基乙醇，30% 胶母液，分离胶缓冲液（pH 8.8），浓缩胶缓冲液（pH6.8），10×电极缓冲液（pH 8.3），2 ×上样缓冲液，染色液，脱色液

试剂盒：质粒提取试剂盒，PCR产物回收试剂盒

培养基：LB液体培养基，LB固体培养基

溶液：60mmol/L氯化钙溶液

抗生素：卡那霉素，氨苄青霉素

2.2 实验仪器