试验八血糖的测定葡萄糖氧化酶法

实验十 血糖的测定
血液中的葡萄糖称血糖。

正常人血糖浓度较恒定，维持在3．9mmol ／L ～6．1mmol ／L 之间。

血糖浓度的相对恒定是机体进行正常生理活动的前提条件之一，有着双重实际意义：其一，维持稳定的能源供给，满足机体在各种生理状态下对能量的需求。

其二，保证机体不因进食致血糖浓度过高，导致糖的丢失。

因此，血糖的测定是临床生化检验实验室的常规检测项目。

血糖测定按其发展过程及反应原理的不同，大致分三类：氧化还原法 ，缩合法（主要有邻甲苯胺法），酶法（主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法）。

下边介绍两种方法供选择。

一、葡萄糖氧化酶法
【目的】
1. 了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理，能进行血糖测定的操作。

2. 掌握血糖测定的临床意义。

【原理】
葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase ，GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。

后者在过氧化物酶 (peroxidase ，POD)作用下，分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物，即 Trinder 反应。

其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在505nm 波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度。

反应式如下：
2H 2O 2+4-氨基安替比林+酚
红色醌类化合物
POD
2H 2O
2H 2O 2
O 2葡萄糖+葡萄糖酸+
GOD
+
【器材】
试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】
1. 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.0）
称取无水磷酸氢二钠8.67g 及无水磷酸二氢钾5.3g 溶于800ml 蒸馏水中，用1mol/L 氢氧化钠（或1mol/L 盐酸）调节pH 至7.0，然后用蒸馏水稀释至1L 。

2. 酶试剂
称取过氧化物酶1200U ，葡萄糖氧化酶1200U ，4-氨基安替比林10mg ，叠氮钠100mg ，溶于上述磷酸盐缓冲液80ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.0，加磷酸缓冲液至100ml 。

置冰箱保存，4℃可稳定3个月。

3. 酚溶液
称取重蒸馏酚100mg溶于100ml蒸馏水中（酚在空气中易氧化成红色，可先配成500g/L 的溶液，贮存于棕色瓶中，用时稀释），用棕色瓶贮存。

4. 酶酚混合试剂
取上述酶试剂与酚溶液等量混合，4℃可以存放一个月。

5. 12mmol/L苯甲酸溶液
溶解苯甲酸1.4g于蒸馏水约800ml中，加温助溶，冷却后加蒸馏水至1L。

6．葡萄糖标准贮存液（100mmol/L）
称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，并移入100ml容量瓶内，再以12mmol/L苯甲酸溶液加至100ml。

7.葡萄糖标准应用液（5mmol/L）
吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml 于100ml 容量瓶中，加12mmol/L 苯甲酸溶液至刻度。

【操作】
取3 支试管,编号，按下表操作。

表3-12 血糖测定操作步骤
加入物 (ml) 空白管标准管测定管
血清－－0.02
葡萄糖标准液－0.02 －
蒸馏水0.02 －－
酶酚混合液 3.0 3.0 3.0
混匀，置 37 ℃水浴中保温 15分钟，在波长 505nm 处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。

【计算】
测定管吸光度
血糖（mmol/L）= ×5
标准管吸光度
标准管吸光度
血清葡萄糖（mmol/L)＝
×5
测定管吸光度
【注意事项】
1．测定结果如超过20mmol／L，应将标本用生理盐水稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。

2．若酶酚混合试剂呈红色，应弃之重配。

因标本和标准用量少，其加量是否准确对测定结果影响较大，故其加量必须准确。

3．GOD-POD法的第一步反应特异性高，而由POD催化的第二步指示反应是非特异性的，易受标本中尿酸、维生素C、谷胱甘肽、胆红素等还原物的干扰，这些物质与色素原竞争H202，使测定结果偏低。

4．Trinder反应由Trinder于1969年提出。

后经许多学者改进，采用2，4-二氯酚、2-羟-3，5-二氯苯磺酸等代替苯酚，由于这些化合物氧化生成的色素的摩尔吸光系数均高于苯酚，使反应灵敏度得以提高。

【正常参考范围】
3.9～6.1mmol/L
【临床意义】
1. 生理性高血糖可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后，或精神紧张、交感神经兴奋，肾上腺分泌增加时。

2. 病理性高血糖
⑴糖尿病：病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。

⑵对抗胰岛素的激素分泌过多：如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛α-细胞瘤等。

⑶颅内压增高：颅内压增高（如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等）刺激血糖中枢，出现高血糖。

⑷脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。

3. 生理性低血糖饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。

4. 病理性低血糖
⑴胰岛素分泌过多：由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。

⑵对抗胰岛素的激素分泌不足：如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退等。

⑶严重肝病患者：肝贮存糖原及糖异生功能低下，不能有效调节血糖。

【结果及分析】
【思考题】
1. 血糖有哪些来源和去路，机体是如何调节血糖浓度恒定的？
2. 酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制，用蒸馏水是否可以，为什么？
二、邻甲苯胺法
【目的】
了解测定血糖的原理和方法，要求在实验中培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力。

【原理】
葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺，后者脱水生成雪夫（Schiff）碱，再经结构重排，生成有色化合物。

颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。

其反应式如下：
葡萄糖 + 邻甲苯胺葡萄糖邻甲苯胺
-H2O
葡萄糖邻甲苯胺雪夫碱
【器材】
试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计
【试剂】
1．邻甲苯胺试剂
于940ml冰醋酸中加入硫脲1.5g, 邻甲苯胺60ml,混合,直至硫脲完全溶解,置棕色试剂瓶中,室温保存。

新配试剂应放置24小时后（待老化）使用。

此试剂腐蚀性强，避免接触皮肤，应用自动吸管加液。

2．12mmol/L苯甲酸溶液
于900ml 蒸馏水中加入苯甲酸1.4g,加热助溶,冷却后置于1L容量瓶中,加蒸馏水至刻度。

3．葡萄糖标准储存液（100mmol/L）
称取无水葡萄糖（预先置80℃烤箱干燥至恒重，移置干燥器内保存）1.802g,溶解于80ml苯甲酸溶液中,移置100ml容量瓶中,再加苯甲酸溶液至刻度。

4．葡萄糖标准应用液（5mmol/L）
取葡萄糖标准储备液5ml，置于100ml容量瓶中，加苯甲酸溶液至刻度。

【操作】
1．取16×150mm试管3支按下表进行操作：
表3-13 血糖测定操作步骤
试剂（ml）测定管标准管空白管
血清或血浆0.1 ——
葡萄糖标准应用液—0.1 —
蒸馏水——0.1
邻甲苯胺试剂 3.0 3.0 3.0
2．将上述各管混匀放入沸水浴中加热12分钟，取出用自来水冷却5分钟。

注意在煮沸时水浴中的水面必须高于试管内的液面。

否则则温度不均而影响比色。

3．用波长630nm分光光度计进行比色，空白管调零点，读取测定管与标准管吸光度。

4．计算
测定管吸光度
血糖（mmol/L）= ×5
标准管吸光度
5．本测定法空腹血糖正常值为3.89～6.11 mmol/L(70～110mg/dl)。

【临床意义】同上。

【结果及分析】
【思考题】
讨论血糖升高和降低的临床意义及其维持恒定的因素？。