蛋白质的定量测定实验报告

程，可查阅实验书P105o

123实验仪器及器材

①V-1100可见光分光光度计;

②恒温水浴箱；

③试管6支、试管架；

④加样枪、加样枪架。

1.3实验步骤

1.3.1实验流程

1.3.2实验步骤

每隔一分钟，依次往1号试管到6号试管中加入2mL的碱性

（2）双缩脲反应硫酸铜溶液，摇匀并记录每支试管的加入硫酸铜时间，室温

静置10min

室温冷却27min

等待20min

比色测定6min

附表

操作技巧：

①在这一次的实验中，关键的要点在于滴加FOlin-酚试剂的摇匀，必须快速摇匀，保证反应优先进行。振荡试管时，振荡的正确方法是用手腕的力左右摆动，使试管中液体混合均匀且不漏出。最后放入到水浴中加热。

②在分光比色的时候，测量一次后重新凋零，不能继续测量等。

操作失误：

全部实验过程中，就出现了一次失误，即在试管4加入Folin-酚试剂，充分摇匀，在放入水浴加热之间，部分液体由于磕碰而溅出。其余操作严格按照要求一步步完成，理论不存在着失误。

分析：Folin-酚与液体已经混合均匀并反应，在后面的水浴加热后，只是影响到了整体的试管4的反应后得到的溶液量，而不影响颜色的变化及最后的比色测定，故该失误不会对实验产生测定的偏差。

2.2实验现象

①在滴加硫酸铜溶液后，摇匀，产生较多的黏性气泡且附着在液体表面。液体颜色

变化不深。

②在滴加Folin-酚试剂水浴加热后，除试管1为淡黄色外，其余试管均成不同的蓝色。具体看下图：

图一水浴后各试管的情况图

分析：标准液的试管中（2-5）蓝色不断加深，同实际的标准液的含量多少正相关，而试管6的颜色不深，在1-2试管之间，根据实验原理初步可以判定的是：该样品液的蛋白质含量将不会在60-80g∕L之间，而是在0-40g∕L。即实验存在一定的问题，详见结果的分析与讨论。

2.3实验原始数据

本次实验原始数据是在500nm的波长下，各试管混合液的吸光度值，结果见下表1

表1 500nm波长吸光度值记录各管吸光度值A500测定次数--------------------------------------------------------------

2 3 4 5 6

10.353 0.561 0.744 0.938 0.172

20.350 0.562 0.744 0.938 0.172

30.351 0.562 0.743 0.938 0.172

各管平均值A 500

三、结果与讨论

3.1数据处理

3.1.1利用原始数据，可得到各管的平均值：

2管：A 500=( 0.353+0.350+0.351)/3=0.3513 ；

3管：A 500=( 0.561+0.562+0.562)/3=0.5617 ；

依次得到4-6管的吸光度值如下所示:

3.1.2 Excel绘制蛋白质的标准曲线

根据用Excel绘制标准曲线PPt所示步骤，最终得到如下结果:

牛血清清蛋白浓度■吸光度标准曲线

图2标准曲线图

2

从图中我们可以看到线性方程：y =0.0062 ∙x , R =0.9659

将样品溶液的吸光度（即y值）代入方程，可得出样品浓度（即X值）;由相关指数值

R2可看出误差大小。y =0∙1720 x = 0.1720 " 0.0062 = 27.74」g / mL

血清蛋白浓度（^g∕ml）= 样品蛋白质浓度× 2× 300

故得血清蛋白浓度为16.65g∕L。

3.2结果

由上数据处理可知，最后的待测样品的蛋白质含量为16.65g/L。而真正的正常人血清蛋白浓度范围为60~80 g/L。因此，存在一定问题，具体分析见 3.3分析与讨论。

3.3分析与讨论

首先，我们回顾了整个操作过程，在整个过程中，我们基本都是按照要求操作，并

不存在着明显的操作问题。通过上面水浴加热后的图可以明显看到，结果的确应该在0-20g∕L 之间。同时我们与和我们一样使用试剂的组讨论后发现，他们的结果也是在10

几左右；同时，很多组测出的结果都偏低，故可以初步判定结果的测量方式上不存在明显冋

题。

其次，回顾全部过程的原理，我们猜测可能存在的造成结果低的情况为：

①在室温冷却后，实验室没有空余的分光光度计，排队时间应该是全部小组中最长的，基本花去30多分钟。而这也导致了最后的显色增强（其具体的显色原因可能为物质间的复杂反应导致）从而使得最后的标准曲线的斜率增大，导致测定的标准的样品液蛋白质含量的下降。即AVB ,如图所示：

②分光光度计的比色杯清晰不干净，存在蒸馏水的稀释，且稀释的总体效果是使样品液的含量测定下降。

③开始实验的试管清洗的不充分，可能存在部分的杂质，导致显色反应的增强。

④分光光度计的几个比色杯透明面被碰到，影响到了液体的吸光度，吸光度的下降, 使得样品液的测定值偏低。

最后，有可能在以后的时间里，可以重新做该实验，从多方面来验证自己的分析。多和老师同学交流，得到较好的结果

3.4复习思考题

显色后会色浅，则必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度 1 —2倍