第九章 亲与纯化技术
《基因工程》第九章 核酸提取与纯化
质粒DNA的提取和纯化 3. 一些大肠杆菌菌株 如HB101的一些变种和衍生株 一些大肠杆菌菌株(如 的一些变种和衍生株) 的一些变种和衍生株 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类， 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随 后用氯化铯—溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时 后用氯化铯 溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时 会出现问题。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒 会出现问题。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所 所 占位置形成一致密的、模糊的区带。 占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质 内污染有糖类， 粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活 内污染有糖类 故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌菌株中大量制 性。故从诸如 和 等大肠杆菌菌株中大量制 备质粒时，不宜使用煮沸法。 备质粒时，不宜使用煮沸法。
质粒DNA的提取和纯化
4. 当从表达内切核酸酶 的大肠杆菌菌株 当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株 的大肠杆菌菌株(endA+株， 株
中小量制备质粒时， 不使用煮沸法。 如HB101)中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因 中小量制备质粒时 建议不使用煮沸法 为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A， 以后在Mg 为煮沸不能完全灭活内切核酸酶 ， 以后在 2+ 存在 下温育时，质粒DNA会被降解 会被降解。 下温育时 ， 质粒 DNA会被降解 。 但如果通过一个附加 步骤(酚 氯仿进行抽提)可以避免此问题 可以避免此问题。 步骤 酚∶氯仿进行抽提 可以避免此问题。
质粒DNA的提取和纯化
质粒DNA DNA的纯化 1.1.3 质粒DNA的纯化
一种处理溴化乙锭的方法： 一种处理溴化乙锭的方法： 溴化乙锭的方法 1. 加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至
0.5mg/ml以下。 以下。 以下 2. 加入0.2体积新配制的 次磷酸和0.12体积新 加入 体积新配制的5%次磷酸和 体积新 体积新配制的 次磷酸和 配制的0.5mol/L亚硝酸钠，混匀。 亚硝酸钠，混匀。 配制的 亚硝酸钠
亲和纯化
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化； 粒径均一的球形粒子。
可供选择的载体
❖ 琼脂糖凝胶
过滤介质均 可作为亲和配基的载体
❖ 蛋白质参与亲和作用的机理
一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点， 呈凹陷或凸起结构。
具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的 各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、 疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。
生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是 亲和作用特异性高的主要原因。
二、影响亲和作用的因素
第四节 亲和吸附平衡 （略）
第五节 亲和色谱过程分析
❖ 亲和色谱操作过程
上样吸附 清洗（洗涤） 洗脱 再生
1、进料吸附（p329)
亲和色谱操作中可能存在的两种吸附：
❖ 亲和吸附：亲和配基与目标分子间的特异性结合 （选择性高） ❖ 非特异性吸附：料液中各种溶质（包括目标产物）
概述
❖ 生物亲和作用（bioaffinity）
定义： 生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种 特异性相互作用称为生物亲和作用或简称亲和作用。
通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。
配基和目标蛋白的可逆性亲和结合可表示为
E＋L E·L
结合常数
Keq
E L EL
结合常数越大，表示 亲和作用越强
其中：E、L和E·L分别表示蛋白、配基和二者形成的复合体。 Keq一般为104~108dm3/mol，太大(接近不可逆结合）洗脱回收困 难，太小则难于有效吸附目标物质。
质粒亲和纯化-概述说明以及解释
质粒亲和纯化-概述说明以及解释1. 引言1.1 概述质粒亲和纯化是一种重要的生物技术方法，用于从混合物中纯化含有特定亲和标签的质粒。
质粒是一种DNA分子，常常被用来在细菌中进行基因工程。
在质粒亲和纯化过程中，利用质粒与亲和基质之间的特定亲和作用，将含有目标质粒的混合物与其他杂质分离出来，最终得到纯净的目标质粒。
质粒亲和纯化具有高效、特异性强和操作简单等特点，已经广泛应用于分子生物学、基因工程等领域。
本文将详细介绍质粒亲和纯化的原理、步骤和应用，希望能为读者提供一些有益的信息和参考。
1.2 文章结构本文主要分为三个部分：引言、正文和结论。
在引言部分，将介绍质粒亲和纯化的概念和背景，说明文章的意义和重要性，以及本文的目的和意图。
在正文部分，将详细讲解质粒亲和纯化的原理、步骤和应用。
其中，质粒亲和纯化原理部分将介绍质粒和亲和纯化的关系，解释其基本原理。
质粒亲和纯化步骤部分将详细描述进行质粒亲和纯化的具体步骤和操作流程。
质粒亲和纯化应用部分将列举一些质粒亲和纯化在生物技术和研究领域的应用例子。
在结论部分，将对本文的内容进行总结，展望质粒亲和纯化的未来发展方向和可能的应用领域，最后以一些结束语来结束全文，强调质粒亲和纯化在科研和生产中的重要性和价值。
1.3 目的:质粒亲和纯化作为一种常用的蛋白表达和纯化技术，在生物医药领域具有广泛的应用。
本文旨在介绍质粒亲和纯化的原理、步骤以及应用，帮助读者了解该技术的基本概念和操作流程，以及在生物研究和生产中的重要作用。
通过深入了解质粒亲和纯化的相关知识，读者可以更加全面地掌握这项技术，为自己的研究工作提供有力的支持和指导。
希望本文能够帮助读者加深对质粒亲和纯化技术的理解，促进科研工作的进展和创新。
2. 正文2.1 质粒亲和纯化原理质粒亲和纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理基于蛋白质或肽链与金属离子或其他亲和配体之间的特异性结合。
在这种技术中，常用的亲和配体包括金属离子如Ni2+、Cu2+等，亲和配体与负载在固定相上的树脂特异性结合，从而可以有效地将目标蛋白质分离纯化出来。
第九章 生物大分子的分离与纯化技术
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例如：基因重组人干扰素r是 一种基因工程产品，其粗 品是7mol/L盐酸胍溶液。 干扰素在盐酸胍 溶液中处 于可逆性失活状态。因盐 浓度太高无法直接上其他 柱，除去盐酸胍后干扰素 又容易 析出来。若使用疏 水作用色谱柱，将此样品 直接进样，既脱除了盐酸 胍，又达到 了复性的效果。 而且一步分离后，干扰素 纯度可达到90%。
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2、流动相的pH值
一般地pH 4～8 ； 常选 pH 7左右。
3、温度
一般在常温或低于常温下操作。 HIC中蛋白质的保留对温度较敏感。 ①在HIC体系中蛋白质处在活性状态， T↑使蛋白质的团状结 构伸展，暴露出更多的疏水基团，疏水作用增强，保留 值 增大。（其他色谱，T↑保留增大） ② T↑传质加快，使保留减小。（对所有色谱均适用） 总之，在疏水色谱中，①比②大，∴ T↑，保留增大。 4、洗脱方式 梯度洗脱。（高浓度盐→低浓度盐）
④不同的蛋白质在相同流 动相中由于疏水基团多少、种类以及表面分布情 况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到 分离。
结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋 白质就容易被洗脱。
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9.2.2 色谱条件
①固定相：常用C4 ～ C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为 填料。孔径25～50nm。 ②流动相： 水溶性有机溶剂（B液） （甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 洗脱能力增大 ＋水（A液） ＋强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ）
9.4.1 亲合色谱的原理 • AC是吸附色谱的一种。但溶质的保留是一种特异的有选择 性的亲合力。填料只是有选择地对一种生物大分子或一类 生物大分子有吸附，对其他物质无吸 附作用，洗脱时先 被分离，分段洗脱或梯度洗脱再将生物大分子从填料上洗 脱下来，从而达到分离目的。
生物制药工艺学习题(含答案
生物制药工艺学习题集（含答案）第一章生物药物概述一、填空：1、我国药物的三大药源指的是化学药物、生物药物、中药2、现代生物药物已形成四大类型，包括基因重组多肽和蛋白质、基因药物、天然生化药物、合成与部分合成的生物药物3、请写出下列药物英文的中文全称：IFN（Interferon）干扰素、IL(Interleukin)白介素、CSF（Colony Stimulating Factor）集落刺激因子、EPO（Erythropoietin）促红细胞生成素、 EGF（Epidermal Growth Factor）表皮生长因子、NGF（Nerve Growth Factor）神经生长因子、 rhGH（Recombinant Human Growth Hormone）重组人生长激素、Ins（Insulin）胰岛素、HCG（Human Choriogonadotrophin）人绒毛膜促性腺激素、 LH 促黄体生成素、SOD超氧化物歧化酶、tPA 组织纤溶酶原激活物4、常用的β-内酰胺类抗生素有青霉素、头孢菌素；氨基糖苷类抗生素有链霉素；大环内酯类抗生素有红霉素；四环类抗生素有土霉素；多肽类抗生素有杆菌肽；多烯类抗生素有两性霉B；蒽环类抗生素有阿霉素5、嵌合抗体是指用人源抗体恒定区替换鼠源抗体恒定区，保留抗体可变区；人源化抗体是指抗体可变区中仅CDR（决定簇互补区）为鼠源，其FR（骨架区）及恒定区均来自人源。
6、基因工程技术中常用的基因载体有质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。
二、选择题：1、以下能用重组DNA技术生产的药物为（B）A、维生素B、生长素C、肝素D、链霉素2、下面哪一种药物属于多糖类生物药物（C）A、洛伐他汀B、干扰素C、肝素D、细胞色素C3、能用于防治血栓的酶类药物有（D）A、SODB、胰岛素C、L-天冬酰胺酶D、尿激酶4、环孢菌素是微生物产生的（A）A、免疫抑制剂B、酶类药物C、酶抑制剂D、大环内酯类抗生素5、下列属于多肽激素类生物药物的是（D）A、ATPB、四氢叶酸C、透明质酸D、降钙素6、蛋白质工程技术改造的速效胰岛素机理是（D）A. 将猪胰岛素B30位改造为丙氨酸，使之和人胰岛素序列一致B. 将A21位替换成甘氨酸，B链末端增加两个精氨酸，使之在pH4溶液中可溶C. 将B29位赖氨酸用长链脂肪酸修饰，改变其皮下扩散和吸收速度D. 将人胰岛素B28位与B29位氨基酸互换，使之不易形成六聚体三、名词解释：1、药物 Medicine(remedy)：用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有4大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药2、生物药物（biopharmaceutics）：是以生物体、生物组织或其成份为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物3、基因药物（gene medicine）：是以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等4、反义药物：是以人工合成的十至几十个反义寡核苷酸序列，它能与模板DNA或mRNA互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA翻译，从而达到抗肿瘤和抗病毒作用5、生物制品（biologics）：是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品6、RNA干涉（RNAi，RNA interference）：是指在生物体细胞内，dsRNA引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程7、siRNA(small interfering RNA) ：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。
11第九章--亲和纯化技术
1
亲和纯化技术概念
利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物 物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification）
2
3
本章内容的重点
1、 掌握亲和层析的基本原理，亲和吸附剂的制备 要点包括载体和配基的选择及其它措施。 2、 熟悉亲和层析的基本操作，洗脱条件的控制及 提高分辨率的方法。 3、 了解亲和层析的用途。 4、 掌握亲和过滤、亲和萃取、亲和沉淀、亲和电 泳的有关概念。
用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
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碳二亚胺缩合法
碳二亚胺为羧 基活化剂。
反应中的脲衍 生物可用有机 溶剂洗涤除去。
49
（三）用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。
62
非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。
离子效应 疏水基团 复合亲和力
63
离子效应
配基与载体-间隔臂的不完全 结合，将无关离子基团引入 吸附剂。
具有离子基团的亲和吸附剂 会影响蛋白质的洗脱行为。
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疏水基团
吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水 区相互吸引，形成非专一性吸附。
疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”： （2）疏水性配基：
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（二）常用载体
纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——壳聚糖 (Chitosan)
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1、纤维素
纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的 渗入。
生物制药工艺学习题第九章亲和纯化技术
第九章亲和纯化技术一、填空题1、亲和层析洗脱方法有，，。
2、亲和力大小除由亲和对本身的决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂、、、、等。
3、亲和层析中常用作别离酶的配基有，，和。
4、亲和层析中非专一性吸附有、、。
5、亲和过滤指的是将和结合运用，它包括和两大方法。
二、选择题1、下面关于亲和层析载体的说法错误的选项是〔〕A.载体必须能充分功能化。
B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。
C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。
D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。
2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是〔〕A.大分子的B.小分子的C.中等大小的D.不确定3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中参加配基的洗脱方法称作〔〕A. 阴性洗脱B. 剧烈洗脱C. 竞争洗脱D. 非竞争洗脱4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作〔〕A. 阴性洗脱B. 剧烈洗脱C. 正洗脱D. 负洗脱三、名词解释1、亲和反胶团萃取〔Affinity-based resersed micellar extraction〕：2、亲和膜：3、二次作用亲和沉淀〔secondary-effect affinity precipitation〕：4、亲和萃取：5、亲和吸附剂：6、负洗脱：四、问答题1、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？2、对亲和层析的公式 LK L V Ve ][100+= 进展说明。
设 K L =10-7，求[L 0] 〔6分〕 3、何谓“手臂〞？其长短与亲和层析效果有何联络？为什么？4、从亲和沉淀的机理和别离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。
第九章 亲和纯化技术〔答案〕一、填空题1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱 ， 特殊洗脱， 专一性洗脱。
2、亲和力大小除由亲和对本身的 解离常数 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂 微环境 、 载体空间位阻 、 载体孔径 、 配基和配体的浓度 、配基构造 等。
第九章其它亲和技术
第三节其他亲和纯化技术一、亲和过滤（膜分离）二、亲和分配（双水相萃取）三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取）四、亲和沉淀（沉淀分级）五、亲和电泳（电泳）一、亲和过滤（Affinity Filtration）将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲和错流过滤和亲和膜分离。
亲和错流过滤（affinity Cross Flow Filtration,ACFF）: 是将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。
亲和错流过滤（affinity Cross Flow Filtration）基质及大分子亲和配基基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。
配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体；用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。
基质聚丙烯酰胺菌类的完整细胞（酵母、芽胞杆菌、链球菌等细胞）琼脂糖、脂质体等酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白A亲和膜（affinity membrane）亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。
将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。
亲和膜优点传质阻力小，达到吸附平衡的时间短；配基利用率高，配基用量低；压降小，流速快；设备体积小。
二、亲和萃取（Affinity extraction）定义：利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。
PEG/Dextran,PEG/无机盐m A目标分子的亲和分配系数T和B分别表示上相和下相；m A和m O为有、无配基时目标分子的分配系数；m L为配基的分配系数；C L为配基浓度；K d为配基与目标分子反应的解离常数。
上相配基浓度CLT 越高，mA越大亲和萃取纯化过程亲和分配（进料），杂蛋白反萃取（清洗）目标产物反萃取（洗脱）。
亲和纯化
亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小， 3）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，特别是经 配基偶联后， 凝胶膨胀度会进一步变小， 配基偶联后 ， 凝胶膨胀度会进一步变小 ， 所以应用受到 限制。 限制。 聚丙烯酰胺凝胶： 碳骨架， 4） 聚丙烯酰胺凝胶：碳—碳骨架，由丙烯酰胺和甲叉双 碳骨架 丙烯酰胺聚合而成， 具有网状三维空间结构。 丙烯酰胺聚合而成 ， 具有网状三维空间结构 。 注意避免 接触强氧化剂， 配基偶联后会使它的网格缩小， 接触强氧化剂 ， 配基偶联后会使它的网格缩小 ， 在一定 程度上限制了它的应用。 程度上限制了它的应用。
亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 纤维素 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠
亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 1）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料， 十分方便。但由于其结构紧密、均一性差， 十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分 子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强， 子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加 上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。 上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主 要用于分离与核酸有关的物质。 要用于分离与核酸有关的物质。 2）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。 琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。 这类载体能使吸附物质保持活性， 这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各 种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。
(四)亲和层析的基本操作
(二)
洗脱方式
1,一步洗脱 一步洗脱 属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂 属于非选择性洗脱方法， 的结合， 的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下 就可得到较纯的分离物。 来，就可得到较纯的分离物。 非选择性洗脱主要受洗脱液的pH、离子强度、 非选择性洗脱主要受洗脱液的pH、离子强度、温度 pH 和介电常数等因素的影响， 和介电常数等因素的影响，有效的洗脱液既能改变 被吸附蛋白质的构象以降低蛋白质与配基之间的亲 和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。 和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。
蛋白质稳态技术中的亲和纯化步骤和实验条件的优化
蛋白质稳态技术中的亲和纯化步骤和实验条件的优化蛋白质是细胞中重要的生物大分子，承担着许多生物学功能。
为了深入研究蛋白质的结构和功能，科学家们开发了各种各样的蛋白质纯化技术。
其中，亲和纯化技术是一种常用且有效的方法，通过利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用，实现目标蛋白质的富集。
亲和纯化是一系列复杂的步骤，其中包括样品制备、亲和基质选择、结合和洗脱条件的优化。
在这些步骤中，合理的实验条件和优化的步骤可以提高亲和纯化的纯度和收率，并最大限度地减少副产物和非特异性吸附。
首先，样品制备非常关键。
在进行亲和纯化之前，需要从生物体中提取目标蛋白质。
为了保持目标蛋白质的活性和稳定性，必须在低温下进行提取，并在提取过程中加入适量的保护剂和抑制剂。
此外，还应选择合适的提取缓冲液和提取方法，以确保目标蛋白质的完整性和纯度。
其次，亲和基质的选择也十分重要。
亲和基质是亲和纯化中的核心组成部分，有选择性地结合目标蛋白质。
常用的亲和基质包括亲和树脂、亲和标记和抗体等。
在选择亲和基质时，需要考虑目标蛋白质和杂质的特性，选择具有高结合选择性的亲和基质。
接下来，结合和洗脱条件的优化可以进一步提高亲和纯化的效果。
在结合条件中，需要选择合适的结合缓冲液和结合温度，以实现目标蛋白质和亲和基质之间的特异结合。
常用的结合缓冲液包括盐溶液和非离子型洗脱剂。
在洗脱步骤中，应选择适当的洗脱缓冲液和洗脱方式，以最大限度地减少非特异性吸附和副产物的存在。
最后，优化后的亲和纯化条件可以通过多种方法进行验证和评估。
其中包括比色法、SDS-PAGE、Western blot等，这些方法可检测纯化蛋白质的纯度、活性和相对分子质量。
根据实验结果，可以进一步调整和优化亲和纯化步骤和实验条件。
在蛋白质稳态技术中，亲和纯化是一种十分重要且常用的方法。
通过合理选择样品制备方法、亲和基质以及优化结合和洗脱条件，可以获得高纯度、高收率的目标蛋白质。
优化后的亲和纯化条件不仅有助于深入研究蛋白质的结构和功能，还可以为后续的实验和应用提供可靠的实验结果。
生物制药工艺学总结(大致按要求整理)
生物制药工艺学名词: 10个20分；选择10个10分；填空10个20分；简答5个30分；论述2个20分。
第一章生物药物概述1.药.、生物药物、生物制品药物：用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质, 有4大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。
生物药物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．, ．综合应用生物与医学、生物化学与分．．．．: ．是利用生物体、生物组织、细胞或其成分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法进行加工、制造而成的．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一大类预防、诊断、治疗和康复保健的制品。
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．广义: 从动物、植物、微生物和海洋生物为原料等制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物；还包括生物工程技术制造生产的新生物技术药物。
医学生物制品：一般指：用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工制成的预防、治疗和诊断特定传染病或其它有关疾病的免疫制剂, 主要指菌苗、疫苗、毒素、应变原与血液制品等。
《新生物制品审批办法》生物制品定义: 是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的, 用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。
2..基因重组药物（基因工程药物）与基因药物有什么区别？基因重组药物属于基因工程药物, 这类药物主要是应用基因工程和蛋白质工程技术制造的重组活性多肽、蛋白质及其修饰物。
而基因药物不是基因工程药物, 这类药物是以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础, 包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。
第二章生物制药工艺技术基础1.生化制药制备工艺的六个环节（1）原料的选择和预处理2）原料的粉碎（3）提取: 从原料中经溶剂分离有效成分, 制成粗品的工艺过程。
第九章 亲和纯化技术
可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
与配基结合的层
析介质称为载体 （Matrix）。
8
配基-底物（Ligand-substance）
配基-底物：亲和对
特异性好
通用性差
9
Ligand
Substance 朱丽叶 杨贵妃 小龙女 祝英台 林黛玉 崔莺莺
梁山伯
10
底物
酶 凝集素
Sepharose
CL,稳定性明显增加，能在pH3~14中应用。
15
3、葡聚糖凝胶：
葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，
应用受到限制。
16
4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P
有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的
亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
配基
受体，载体蛋白 抗原，病毒，细胞
谷胱甘肽 核酸
金属离子 抗体 激素，维生素
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聚（His）融合蛋白，表面具有Cys/Trp残基
互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，核酸结合蛋 白
谷胱甘肽-S-转移酶，GST融合蛋白 多糖类，糖蛋白，细胞表面受体，细胞 底物类似物，抑制剂，辅助因子
二、载体
（一）、亲和层析对载体的要求：
功能化，与配 基进行共价连 接
有较好的理化 稳定性和生物 惰性
具有高度的水 不溶性和亲水 性
具有多孔的立 体网状结构
应为大小均匀 的刚性小球
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（二）、常用载体
纤维素 (cellulose) 壳聚糖 (Chitosan) 琼脂糖凝胶
多孔玻璃珠
（Bio-Glass）
聚丙烯酰胺凝胶
第九章生物物质分离与纯化 ppt课件
SDS PAGE of Purification
10 micrograms loaded in each lane
六、最后加工 包括结晶和枯燥
Industrial Scale up
To transfer the pilot scale results into a commercially feasible production setting.
经过参与一些中性盐，导致胶体出现凝聚的不稳定的景 象。表征电解质凝聚才干的大小用凝聚价，即使胶粒 发 生凝聚作用的最小电解质的浓度。因此反离子价数越高 该值就越小，凝聚才干就越强。常用的凝聚剂为明矾， AlCl3·6H2O, FeCl3, ZnSO4, MgCO3。采用凝聚的方 法得到的凝聚体颗粒比较小。
改动发酵液的性质，以利于固液分别。经过酸化、加热、 以降低发酵液的黏度。
经过参与絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的 颗粒。絮凝剂为人工合成的高分子聚合物，如聚丙烯酰 胺和聚乙烯亚胺衍生物，天然的有机高分子物质，如壳 聚糖和葡聚糖的聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生 物产生的物质如糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮 凝法常可得到粗大的絮团。
Supercritical Fluid Extraction
6; 固体吸附： 是物质从液相〔发酵液〕到固相〔吸附剂〕发生物质的转移。此法 用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质的分别和提取。 按照吸附剂的作用原理：分为三大类。 A物理吸附： 依托范德华力的作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛 和氧化铝等。 B静电吸附： 借助静电引力吸附物质。主要为合成的树脂。 C: 亲和吸附： 在树脂上嫁接一个能与要分别的物质发生特异性反响的配基。
二、发酵液的固液分别
经过固液分别，去除了发酵液中的固相 物质，为后续过程提供廓清或干净的原 料液体。通常采用的单元操作为过滤和 离心。
亲和纯化等其他纯化方式
亲和纯化等其他纯化方式亲和纯化是一种常见的蛋白质纯化方式，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
除了亲和纯化外，还有许多其他的蛋白质纯化方式，如离子交换纯化、凝胶过滤纯化、逆流纯化等。
下面是对这些纯化方式的介绍和应用。
一、亲和纯化亲和纯化是利用目标蛋白质与配体之间的亲和作用实现的一种纯化方式。
常见的亲和纯化方法包括亲和层析、亲和吸附和亲和电泳等。
亲和层析是最常用的亲和纯化方法之一，其基本原理是将含有某种特定亲和配体的固定相与蛋白混合，使目标蛋白与亲和配体相结合，然后通过洗脱步骤将目标蛋白从其他杂质中分离出来。
亲和层析常用的亲和配体有金属离子、抗体、亲和标记分子等。
二、离子交换纯化离子交换纯化是利用蛋白质分子的带电特性进行分离的一种纯化方法。
其基本原理是通过蛋白质与离子交换基质之间的静电相互作用来实现分离和纯化。
离子交换基质一般是具有阴阳离子交换功能的柱子，可根据蛋白质带电性质的不同选择合适的离子交换材料。
通过调节溶液pH值和离子强度，可以控制蛋白质与离子交换基质的相互作用，实现对目标蛋白的选择性吸附和洗脱。
三、凝胶过滤纯化凝胶过滤纯化是一种根据蛋白质的分子大小进行分离的方法。
该方法通过使用一系列孔径大小不同的凝胶过滤材料，使较大分子的蛋白质无法通过凝胶网孔，从而实现蛋白质的分离和纯化。
凝胶过滤纯化是一种较为简便快速的纯化方式，适用于分离具有不同分子大小的蛋白质混合物。
四、逆流纯化逆流纯化是一种应用于离子交换和亲和纯化中的技术。
其基本原理是通过动态对流和逆流洗脱的方式，增强目标蛋白质与固定相之间的相互作用，从而实现高效的分离和纯化。
逆流纯化不仅能提高蛋白质的纯化效率，还可以有效去除杂质和保护目标蛋白的生物活性。
在蛋白质纯化领域，亲和纯化、离子交换纯化、凝胶过滤纯化和逆流纯化等方式都有各自的优点和应用范围。
科研工作者和生物制药工程师可以根据实际需求选择合适的纯化方法，以实现对目标蛋白质的高效分离和纯化。
亲和纯化技术
亲和色谱
-间隔臂的作用
当配基分子量较小时，为 了排除空间位阻作用，需 要在配基和载体之间连接 一个“间隔臂”
间隔臂的长度有一定限制， 超过一定长度后，配基与 目标分子的亲和力会减弱
亲和色谱
-影响亲和吸附的因素
杂质的影响
料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质 的非特异性吸附，会大大降低纯化效果 杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材 料、配基固定化方法等众多因素相关
亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场 使介质与目标分子共同沉淀
亲和色谱定义
亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 物质的液相色谱法。
亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲 和吸附介质（亲和吸附剂）
亲和色谱原理
亲和色谱操作与一般的固 定床吸附操作方式相似，
多采用断通式前端分析
法，分为进料、杂质清 洗、目标产物洗脱合层 析柱再生四步。
亲和色谱原理
料液进料（feedstock loading）
组氨酸 肝素
肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量 为5到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。
亲和色谱
-亲和色谱介质应满足条件
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；
物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子
介质的活化方法－溴化氰法
亲和膜-定义
亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜
为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质， 是固定床亲和层析的变型。
亲பைடு நூலகம்膜-亲和膜的提出
固定床亲和层析的缺陷
以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限 放大困难（放大采用径向放大）
亲和层析分离纯化技术
亲和层析分离纯化技术亲和层析分离纯化技术，这可是个厉害的玩意儿呢！咱就这么说吧，它就像是一位超级厉害的伯乐，能从一堆“千里马”中精准地挑出那匹最特别的。
你看啊，在这个复杂的生物世界里，各种物质混合在一起，就好像是一场混乱的派对。
而亲和层析呢，就像是派对上那个最有眼光的人，能一下子找到它要找的目标。
它的原理其实也不难理解。
就好比你有一个特别喜欢的东西，比如一个特定的玩具，然后你就会对这个玩具特别敏感，能一下子在一堆玩具中找到它。
亲和层析就是利用这种类似的原理，通过一个特定的“结合位点”，去和目标物质紧密结合。
比如说，咱要纯化一种蛋白质。
那亲和层析就会用一个专门针对这种蛋白质的“诱饵”，把它给吸引过来，然后牢牢地抓住它，其他的杂质就被排除在外啦。
这多厉害呀！这技术在生物领域的作用那可太大了。
就好像是一个神奇的魔法棒，能让科学家们在研究和应用中如鱼得水。
想想看，如果没有亲和层析，要从那么多复杂的混合物中分离出我们想要的东西，那得费多大的劲啊！简直就像是在大海里捞针。
但有了它，就像是有了一双神奇的眼睛，一下子就能找到那根针。
而且啊，亲和层析还特别精准。
它不会随便乱抓一气，而是只针对它设定好的目标。
这就好比一个神枪手，一枪一个准，绝不会打偏。
它的应用那也是相当广泛呢！在制药行业，能帮助分离出有效的药物成分；在生物技术领域，能助力研究各种生物分子的特性。
这不就是在为我们的科技进步添砖加瓦嘛！再想想，要是没有亲和层析，我们怎么能得到那么纯净的生物制品呢？那我们的医学研究、药物开发不都得受到很大的影响嘛！所以说呀，亲和层析分离纯化技术真的是太重要啦！它就像是一位默默无闻的英雄，在背后为我们的科技发展贡献着自己的力量。
我们真应该好好感谢它，不是吗？你说，这么厉害的技术，我们能不好好研究它、利用它吗？它可真是生物领域的一大宝贝呀！。
第八章亲和纯化技术
（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法
• 重氮化法 (含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
26
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五、 影响吸附亲和力的几个因素
• KL
• 配基浓度对亲和力的影响
• 空间障碍的影响 • 配基与载体的结合位点的影响 • 载体孔径的影响 • 微环境的影响
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（一）、配基浓度对亲和力的影响
• 为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值≥10 。
• 配基浓度与亲和对解离常数相关。
• 对于低亲和力系统，配基浓度。
28
第28页，共64页。
（二）、空间障碍的影响
• 空间位阻。 • 对于分子大的配体以及小分子
配基更明显。
• “手臂”，增加与载体相连配 基的活动度，减轻载体的立 体障碍。
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七、 亲和层析的吸附和洗脱
• 影响吸附的条件 • 亲和层析的洗脱 • 亲和吸附剂的再生
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（一）、影响吸附的条件
• 亲和吸附剂及配体的性质
• 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。
• 温度升高会使吸附作用减弱。
• 流速每小时低于10 ml/cm2。 • 层析柱用前必须充分平衡。 • 上样体积为柱床体积的5%。
； • （4）洗脱目标物。
3
第3页，共64页。
亲和纯化技术
• 亲和层析(Affinity chromatography) • 亲和过滤（膜分离） • 亲和分配（双水相萃取） • 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） • 亲和沉淀（沉淀） • 亲和电泳（电泳）
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第九章亲和纯化技术
一、填空题
1、亲和层析洗脱方法有，，。
2、亲和力大小除由亲和对本身的决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂、、、、等。
3、亲和层析中常用作分离酶的配基有，，和。
4、亲和层析中非专一性吸附有、、。
5、亲和过滤指的是将和结合运用，它包括和
两大方法。
二、选择题
1、下面关于亲和层析载体的说法错误的是（）
A.载体必须能充分功能化。
B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。
C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。
D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。
2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是（）
A.大分子的
B.小分子的
C.中等大小的
D.不确定
3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作（）
A. 阴性洗脱
B. 剧烈洗脱
C. 竞争洗脱
D. 非竞争洗脱
4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作（）
A. 阴性洗脱
B. 剧烈洗脱
C. 正洗脱
D. 负洗脱
三、名词解释
1、亲和反胶团萃取（Affinity-based resersed micellar extraction）：
2、亲和膜：
3、二次作用亲和沉淀（secondary-effect affinity precipitation）：
4、亲和萃取：
5、亲和吸附剂：
6、负洗脱：
四、问答题
1、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？
2、对亲和层析的公式 L
K L V Ve ][100+= 进行说明。
设 K L =10-7，求[L 0] （6分） 3、何谓“手臂”？其长短与亲和层析效果有何联系？为什么？
4、从亲和沉淀的机理和分离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。
第九章 亲和纯化技术（答案）
一、填空题
1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱 ， 特殊洗脱， 专一性洗脱。
2、亲和力大小除由亲和对本身的 解离常数 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和
吸附剂 微环境 、 载体空间位阻 、 载体孔径 、 配基和配体的浓度 、
配基结构 等。
3、亲和层析中常用作分离酶的配基有 酶抑制剂 ， 辅酶 ， 底物
和 底物结构类似物 。
4、亲和层析中非专一性吸附有离子效应、疏水基团、复合亲和力。
5、亲和过滤指的是将 亲和层析 和 膜过滤技术 结合运用，它包括 亲和错流过滤
和 亲和膜分离 两大方法。
二、选择题
1、下面关于亲和层析载体的说法错误的是 （ B ）
A.载体必须能充分功能化。
B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。
C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。
D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。
2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是 （ A ）
A.大分子的
B.小分子的
C.中等大小的
D.不确定
3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作（C ）
A. 阴性洗脱
B. 剧烈洗脱
C. 竞争洗脱
D. 非竞争洗脱
4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作（D ）
A. 阴性洗脱
B. 剧烈洗脱
C. 正洗脱
D. 负洗脱
三、名词解释
1、亲和反胶团萃取（Affinity-based resersed micellar extraction）：
是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。
2、亲和膜：
利用亲和配基修饰微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。
将一张微滤膜比喻为一个固定床，则膜厚即为床层高度.优点是传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高；压降小，流速快，设备体积小，配基用量低。
3、二次作用亲和沉淀（secondary-effect affinity precipitation）：
利用在物理场（如pH、离子强度、温度和添加金属离子等）改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。
亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法成为二次作用亲和沉淀。
4、亲和萃取：
利用聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）或聚乙二醇/无机盐等双水相系统萃取分离蛋白质等大生物分子，特别是胞内酶的双水相萃取法。
利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。
5、亲和吸附剂：
由载体及配基偶联构成，在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand），与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。
6、负洗脱：在双底物反应中，与配基互补的酶的亲和吸附，如果吸附取决于A物的存在与否，则洗脱液中除去A物时，吸附在配基上的互补分子也会洗脱下来，这种洗脱方法也称负洗脱。
四、问答题。