出口水果中赤霉素残留量检验方法

出口水果中赤霉素残留量检验方法

1.适用范围

本方法适用于出口柑桔中赤霉素残留量的检验。

2.原理概要

以丙酮提取样品中赤霉素，然后用乙酸乙酯提取，再用缓冲溶液反提取后，在薄层层析板上除去干扰物质，最后用荧光分光光度法测定。

3.主要试剂和仪器

3.1.主要试剂

丙酮：分析纯；

乙酸乙酯：分析纯；

硫酸：优级纯；

硫酸溶液：50%(V/V)；

乙醇：分析纯；

甲醇：分析纯；

缓冲溶液(pH7)：溶解6.7g分析纯磷酸二氢钾和1.2g分析纯氢氧化钠在1 000mL蒸馏水中；

展开剂：氯仿-乙酸乙酯-冰乙酸(10＋4＋1.6)；

乙醇-硫酸溶液：(9＋1)；

硫酸溶液：85%(V/V)，将85mL硫酸缓慢加入15mL蒸馏水中；

硅胶G：薄层层析用；

赤霉素标准品：纯度≥95%；

赤霉素标准溶液：准确称取适量的赤霉素标准品，用甲醇配成浓度1.00mg/mL的标准储备溶液，根据需要再配成适当浓度的标准工作溶液。

3.2.仪器

荧光分光光度计：备有10mm石英池；

锥形瓶：具磨口塞，500mL；

组织捣碎机；

布氏漏斗；

振荡机；

圆底烧瓶：1000mL；

酸度计；

旋转蒸发器；

分液漏斗：250mL；

涡旋混合器；

离心管：具磨口塞，5mL、10mL；

紫外灯：发射波长365nm；

硅胶薄层板的涂布：在20cm×20cm玻璃层析板上将硅胶G(硅胶-水＝1＋3)涂布成0.3mm的薄层板，自然干燥30min。于110℃烘箱中活化1h，冷却后放置干燥器中备用；

微量注射器：25μL。

4.试样的抽取与制备

4.1.检验批

以不超过1500件为一检验批。

同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。

4.2.抽样数量

批量，件最低抽样数，件

1～25 1

26～100 5

101～250 10

251～1500 15

4.3.抽样方法

按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取500g。作为原始样品，原始样品总量不得少于2kg。加封后，标明标记，及时送实验室。

4.4.试样制备

将所取混合原始样品缩分出1kg，取可食部分，经组织捣碎机捣碎，均分成两份，装入洁净容器内，作为试样。密封，并标明标记。

4.5.试样保存

将试样于－18℃以下冷冻保存。

注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

5.过程简述

5.1.提取

称取试样100g(精确到0.1g)于锥形瓶内，加20mL蒸馏水和125mL丙酮，振荡30min。混合物经布氏漏斗抽滤；试样和残渣放回锥形瓶中，再用125mL丙酮重复振荡15min，再以铺有新滤纸的布氏漏斗抽滤。用50mL丙酮洗涤锥形瓶并倒在滤渣上，抽滤，再用100mL丙酮洗涤残渣并过滤。

5.2.净化

将丙酮-水提取液收集于1 000mL圆底烧瓶中，在30℃水浴上，用旋转蒸发器减压蒸发至丙酮完全除去。剩下的试样水溶液用折叠滤纸过滤，用50mL蒸馏水洗涤烧瓶并通过同一滤器过滤，再用2×10mL蒸馏水洗涤滤纸。将滤液转入烧杯中，滴加50%的硫酸溶液，调至pH为2.5±0.2。将样液定量转入250mL分液漏斗中，以少量蒸馏水洗涤烧杯。然后用3×50mL乙酸乙酯提取，收集乙酸乙酯提取液于第二个分液漏斗中。再用3×50mL pH7的缓冲溶液提取。弃去乙酸乙酯相。收集缓冲溶液提取液于250mL烧杯中，用50%的硫酸溶液调至pH2.5±0.2，再将溶液转入第三个250mL分液漏斗中，用3×50mL乙酸乙酯提取。收集乙酸乙酯相，并通过折叠滤纸滤入250mL圆底烧瓶中，于30℃水浴中旋转蒸发至干。准确加入1.0mL乙酸乙酯以溶解残留物。立即转入5mL离心管，冰浴冷却5min，以2500r/min离心5min。

5.3.薄层分离

在制备好的硅胶薄层板上，离底部2cm的线上分别点加25μL样液和10μL 赤霉素标准溶液(10μL/mL)。自然干燥后放入装有新配制的氯仿-乙酸乙酯-冰乙酸(10＋4＋1.6)展开剂的密闭槽内，让展开剂上行展开15cm，取出。自然干燥后，用玻璃板遮住薄层展开后的样品部分，用乙醇-硫酸(9＋1)溶液喷撒薄层展开后的标准样品部位，于100℃烘箱中加热10min。冷却后，在暗室的紫外灯(发射波长365nm)下观察，以此来对照标出样品部分相应的赤霉素组分区。将样品的赤霉素组分区域刮下，转入10mL离心管中，加1mL蒸馏水，混合、溶解，置冰浴中冷却5min。同时吸取2.0mL标准溶液(含赤霉素2μg)到第二个试管中，冰浴冷却5min，在每个试管中加入5mL已冷却的85%硫酸，继续在冰浴中冷却

10min。取出试管，室温静置1h。供荧光分光光度法测定。

5.4.测定

5.4.1.荧光条件

激发波长：416nm。

发射波长：462nm。

5.4.2.荧光测定

分别将新制备的样品溶液和标准溶液装入清洁的石英池中，依次放入仪器内，测定每个溶液的荧光强度。

5.5.空白试验

除不加样品外，按上述测定步骤进行。

6.结果计算

按下式计算：

X＝E·c·V E

s

·m

式中：X——试样中赤霉素残留量，mg/kg；

E——样液中赤霉素的荧光强度；

E

s

——标准工作溶液中赤霉素的荧光强度；

c——标准工作溶液中赤霉素的浓度，μg/mL；

V——样液最终定容体积；

m——最终样液中所代表的试样量，g。

注：计算结果需扣除空白值。

7.低限、回收率的测定

7.1.测定低限：

本方法测定低限为0.03mg/kg。

7.2.回收率

回收率的实验数据：赤霉素添加浓度在0.03～0.2mg/kg范围内，回收率为87.7%～94.3%。