细胞免疫荧光操作要点

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细胞免疫荧光操作要点

细胞免疫荧光操作要点

细胞免疫荧光操作要点细胞免疫荧光操作是生命科学中常用的实验技术之一,用于研究细胞的免疫反应和细胞代谢。

本文将介绍细胞免疫荧光操作的要点,包括实验材料准备、样本处理、荧光染色、显微镜观察等方面。

一、实验材料准备在进行细胞免疫荧光操作前,需要准备以下实验材料:1. 细胞培养物:根据实验需要选择合适的细胞系,并进行培养和传代。

2. 细胞培养基:根据细胞系的要求选择合适的培养基,添加适量的培养液,维持细胞的正常生长。

3. 抗体:选择与目标蛋白质相应的特异性抗体。

4. 荧光染料:选择合适的荧光染料,如荧光素二硫苏葡萄糖(DAB)或二苯基氨基苯硫酰氯酸盐(DAP)。

二、样本处理样本处理是细胞免疫荧光操作的关键步骤之一,包括细胞固定、渗透处理和抗原检测等过程。

1. 细胞固定:用适当的固定剂(如4%的乙醛或甲醛)处理细胞,使其保持原有形态。

2. 渗透处理:使用适当的渗透剂(如0.5%的Triton X-100)破坏细胞膜,以增加抗体和荧光染料的渗透性。

3. 抗原检测:将抗体与样本中的抗原结合,形成抗原-抗体复合物。

三、荧光染色荧光染色是细胞免疫荧光操作的重要环节,用于标记和检测抗原-抗体复合物。

1. 加入初级抗体:将稀释后的初级抗体加入样品中,与目标蛋白质发生特异性反应。

2. 清洗:用缓冲液洗涤样品,去除未结合的抗体。

3. 加入荧光标记的二抗:将与荧光物质标记的二抗加入样品中,与初级抗体发生特异性反应。

4. 清洗:再次用缓冲液洗涤样品,去除未结合的二抗。

5. 定性:使用荧光显微镜观察样品,并捕捉荧光信号。

四、显微镜观察显微镜观察是细胞免疫荧光操作的最后一步,用于分析和记录荧光染色的结果。

1. 调节显微镜:根据荧光染色的需要,选择合适的荧光通道和激发波长。

2. 观察:将样品放置在显微镜台上,以适当的放大倍数观察荧光信号的强度和分布。

3. 拍照:使用相机或图像系统拍摄显微镜下的荧光图像,记录实验结果并备份数据。

细胞免疫荧光操作是一项技术性较强的实验技术,要求实验者具备一定的实验操作经验和相关知识。

免疫荧光双标操作方法及注意事项

免疫荧光双标操作方法及注意事项

免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍:方法:1.样品制备:a.细胞:将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤,并以适当浓度悬浮于PBS(磷酸盐缓冲液)中。

b.组织:从动物体内取出组织样本,用PBS洗涤并切成适当大小的块。

2.固定:a.细胞:用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。

b.组织:用适当浓度的乙醛固定组织样本,然后在PBS中冲洗。

3.渗透:a.细胞和组织:将样本浸泡在PBS-T(含0.2%的肌凝蛋白酶)中,进行渗透处理,以增强抗体的渗透性。

4.阻断:a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。

5.主抗体孵育:a.加入适当稀释倍数的一抗(特异抗体),孵育样本,可以在室温或4°C条件下进行。

6.洗涤:a. 用PBS-T或TBST(含0.1%的Tween 20)进行多次洗涤,以去除未结合的一抗。

7.次抗体孵育:a.加入适当稀释倍数的二抗(荧光标记的抗体),与一抗结合后,通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。

8.洗涤:a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤,以去除未结合的二抗。

9.核染色/细胞膜染色:a.加入DNA染色剂(如DAPI)或细胞膜标记(如细胞膜标记染料),用于定位目标蛋白。

10.显微镜观察:a.将样本放置在玻片上,用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。

注意事项:1.温度控制:孵育和洗涤过程中,适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。

2.抗体稀释倍数:需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。

3.阻断剂的选择:根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。

4.试剂保存:将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下,避免暴露在光和高温下。

5.孵育时间:一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。

6.具体细胞/组织类型的处理:不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法,可以参考试剂手册或已发表的方法。

免疫荧光法(免疫细胞化学)

免疫荧光法(免疫细胞化学)

免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法,也称为免疫细胞化学,是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。

该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合,通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。

本文将介绍免疫荧光法的基本原理,实验步骤和应用领域。

一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。

在免疫细胞化学中,荧光标记的抗体与靶分子结合后,可以通过激发荧光,从而使得靶分子在细胞或组织中可见。

这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。

直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合,制备成荧光标记的抗体。

这种方法操作简单,适合用于单一标记物的检测,但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。

间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合,然后再将第二抗体与荧光标记结合。

这种方法可以使用多个不同的抗体,并能将多个目标同时检测,具有高度特异性和灵敏度。

但是,操作过程相对繁琐,需要较长时间。

二、实验步骤1. 样本制备:取得所需检测的细胞或组织样本,处理好固定和预处理的步骤。

例如,细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作,组织则需进行切片和脱水等步骤。

预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。

2. 抗体染色:将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上,充分孵育,以实现抗原和抗体结合。

3. 清洗:将标本进行适当的冲洗,使未结合的抗体、标记物等被去除。

4. 结果观察:将标本放置在荧光显微镜下观察,通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。

5. 形态学观察:根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号,判断目标分子的定位和表达情况。

三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。

以下是其主要应用领域的一些例子:1. 免疫细胞凝集试验:用于检测抗原与抗体间的反应,如血型鉴定等。

2. 免疫组织化学:通过检测和定位特定分子在组织中的分布,来研究疾病的发生和发展机制,如肿瘤标记物的检测等。

细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光1、吸干十二孔板中每孔中的培养基,用PBS洗三次,5min/次,注意摇床要缓慢。

2、吸干PBS,每孔加200~300μl固定液,室温固定20分钟。

3、若暂时不做荧光,吸干固定液,不洗,放-30℃保存。

4、需要做时,将十二孔板取出,稍微解冻之后,加适量的PBS,用钩针抠出要PBS洗三次,5min/次。

5、吸干PBS后,每孔加1ml的5‰Triton破膜液,室温下破膜15~20分钟。

6、吸干破膜液,室温下PBS洗3次,5min/次。

7、加BSA封闭液,30~50μl/爬片,室温下封闭30min。

8、吸干BSA封闭液,不洗,加一抗(一抗用PBS稀释比例为:1:50~1:100,浓度视具体情况而定,30~50μl/爬片)4℃过夜。

注意十二孔板保持平整,以免一抗流到爬片外。

9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板,PBST洗3次,3min/次,然后每孔加1:50稀释的FITC,室温下避光孵育1h。

10、PBST洗3次后,DAPI染核6分钟,30μl/爬片。

染核后PBST洗3次,5min/次。

11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液,即可镜下观察。

说明:①5‰Triton破膜液:例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。

②FTIC现配现用,用PBS稀释,比例为1:50~1:75,具体浓度依据荧光亮度来调整。

耗材:1、十二孔板2块,一块要求无菌(种细胞),另一块洁净(外用漂洗爬片)。

2、外用PBS3、固定液4、细胞爬片5、避光盒6、钩针7、5‰Triton破膜液8、BSA封闭液9、一抗10、PBST11、FITC12、DAPI13、GL YCEROL封片液。

细胞免疫荧光操作要点

细胞免疫荧光操作要点

细胞免疫荧光操作要点预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制细胞免疫荧光:取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液。

将细胞接种到24孔板中,置5%C02培养箱培养1天,待细胞接近长成单层,取出孔板,4%多聚甲醛37℃,固定30min,含1%Triton X-l00的PBS溶液37℃作用30min增加细胞膜的通透性,非免疫动物血清37℃封闭40分钟,吸净血清后分孔做好标记加入抗体(1:100),4℃湿盒过夜,次日预冷的PBS溶液冲洗5分钟×3次后避光加入分别相应的荧光标记二抗(1:50),加入异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)(绿色)标记的二抗(1:50)置湿盒内,避光37℃,孵育30分钟,PBS冲洗5分钟×3次后,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(1:1000)避光37℃复染细胞核20分钟。

PBS冲洗5分钟×3次后,使用倒置荧光显微镜(TE2000,NIKON)观察成像。

阴性对照用PBS代替一抗,其余步骤同实验组相同。

1%Triton X-l00所起的作用应该是溶解膜上的脂质分子,从而增加膜的通透性,使抗体容易进入细胞。

一般30min足以,如果是核内蛋白,可以适当增加时间。

目的蛋白是NFKBp65,检测它在乳腺癌MDAMB231细胞里的核转位情况,我用的一抗二抗都是CST的,我用的步骤是1 甲醇-20度固定5分钟(建议用4%多聚甲醛固定,使用多聚甲醛前(因为一般配好的多聚甲醛都放在4度冰箱内避光保存)平衡至室温再用,否则细胞会遇冷收缩,形态发生改变。

不需要透膜。

)2 pbs-0.2﹪triton漂洗3次,pbs-1﹪triton破膜15分钟,然后再洗三次洗涤液同上3 5﹪BSA封闭1h4 一抗1:100 4度孵育了近20小时,然后洗三次5 二抗1:150避光室温1h免疫荧光第一步的步骤几注意事项1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化.4. 不知道你的一抗是在胞浆表达还是在胞核表达如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液.6. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP 管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.7. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失.注意,PBS液的PH值要调在7.4左右免疫荧光第二步的步骤及注意事项1. 等抗体孵育过后,取出洗片,这是要注意不要把不同抗体的片子混在一块了(比如冲洗玻片的吸头要一对一,冲完一种抗体后要去掉,换另一个再冲)2. 洗后自然晾干,加荧光二抗(一般这也要摸个浓度,并不能按部就班地照着说明书上稀释),室温孵育45-60分钟,注意要避光,虽说荧光除非再紫外灯下才会淬灭的快,但操作时还是要注意避光3. PBS洗,洗的时候还是要注意避光4. 洗后自然晾干,加第二种荧光探针(我做的是一抗在胞浆表达,加第二种荧光谈针是染核,这样便于计数)孵育10-15分钟,避光条件下作用,洗片时也要避光.5. 自然晾干后,50%缓冲甘油封片.常见问题分析:背景强,有可能1、玻片是否处理得当;2、洗片没洗干净;3、洗片用的PBS很脏;4、抗体用前没有稍离心,离心过后取上清进行稀释;5、用的荧光二抗浓度太高,并不是说坑体浓度高就会增强荧光,相反,会增加背景染色。

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤第一步:样本准备1.根据实验需要,选择并培养适当的细胞系或组织样本。

2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。

3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。

第二步:固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液(如甲醛)或有机溶剂(如甲醇)将细胞/组织进行固定处理。

2.在室温或低温下,将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中,进行固定处理。

3.固定后,用洗涤缓冲液(如PBS)洗涤细胞/组织,去除多余的固定液。

4.在细胞内透明化的同时,保持细胞结构完整。

第三步:抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。

一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体,二抗是带有荧光染料的抗体。

2.将一抗稀释到适当的浓度,并加入到载玻片或孔板中,与细胞孵育。

3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟,使抗体与待检测的蛋白相结合。

4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板,去除多余的一抗。

5.同样的方法,添加二抗到载玻片或孔板中,并孵育30-60分钟,使二抗与一抗结合。

6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板,去除多余的二抗。

第四步:显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头,观察载玻片或孔板上的细胞,并选取合适的区域进行观察。

2.使用适当的荧光滤波片,观察细胞中的荧光信号。

3.根据实验设计的需要,进行图像记录和分析。

细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术,可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位,提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。

不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异,因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。

细胞免疫荧光探针实验步骤

细胞免疫荧光探针实验步骤

细胞免疫荧光探针实验步骤
本文档旨在介绍细胞免疫荧光探针实验的步骤和操作方法。


下是实验进行的详细步骤:
准备工作
1. 对所需的培养基和溶液进行准备和标记。

2. 提前处理所需的细胞并保持在适当的条件下。

3. 准备实验所需的培养皿和荧光显微镜。

样本处理
1. 将处理好的细胞均匀地悬浮于培养基中。

2. 将细胞悬浮液等份分装到培养皿中。

3. 确保细胞均匀附着于培养皿,并将培养皿放入恒温培养箱中。

荧光探针处理
1. 根据实验需求选择合适的荧光探针。

2. 将荧光探针稀释到适当的浓度。

3. 将稀释好的荧光探针加入到细胞培养皿中。

4. 将培养皿放回恒温培养箱中,并在适当的时间内进行探针的染色。

荧光显微镜观察
1. 取出培养皿,用细胞培养基洗涤干净。

2. 在荧光显微镜下观察细胞,调整合适的荧光激发波长和观察滤光片。

3. 观察并拍摄细胞荧光信号。

数据分析
1. 导出拍摄的荧光图像。

2. 使用相应的图像处理软件对荧光图像进行分析。

3. 记录并分析荧光强度、荧光区域等参数。

请参考以上步骤进行细胞免疫荧光探针实验,并根据实验需求进行适当的修改和优化。

祝实验顺利!。

细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光步骤

要领一:之阳早格格创做1.最先需要把细胞养正在玻璃片上(悬浮细胞需要用多散好氨酸包被过的玻璃片)2.而后正在4%PFA内里室温下牢固30分钟,PBS洗二次,0.1% TX-100室温下效率1-2分钟使细胞膜通透.3.接下去举止荧光标记表记标帜,需要正在一个大的容器(里积大,扁仄状的,比圆大的培植皿)内里,搁一弛用火挨干的滤纸,以脆持干度.4.剪一片符合大小的parafilm,正在上头滴上稀释正在1%BSA/TBS中的一抗(稀释倍数依简曲抗体而定),每个玻璃片30ul脚够,把玻璃片盖正在上头(细胞里往下),室温下孵育30分钟,而后正在PBS里洗三次.5.接下去二抗孵育步调共上.6.末尾,正在载玻片加上mounting medium(约莫每个玻璃片加10ul),把玻璃片搁上去(细胞里往下),37度30分钟,而后便不妨正在荧光隐微镜下瞅察了.7.抗体很要害,不克不迭有非特同性分离.您不妨先搞WB检测一下您的抗体,瞅瞅有不纯戴.8.单目标话,不妨把二个一抗所有加大概者分别标记表记标帜二次(不妨皆试一下瞅瞅那种要领符合).如果一个抗体需要二抗,一个是间接荧光标记表记标帜的,不妨把荧光标记表记标帜的那个战其余一个的二抗所有加.要领二:1.采用一抗时要根源于二种分歧的动物,尔用的是根源于rabbit战rat的抗体,二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的,尔用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)战donkey anti-rat-Tex-Red(黑).2.尔的搞法是二种一抗共时孵育,而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要留神摸索,尔感觉一抗4度孵育过夜比较佳,背景比较浑晰.3.尔的阳性对付照用的是阳性构造切片,阳性对付照则分别是家兔战大鼠的IgG,荧光标记表记标帜物对付照是PBS+荧光标记表记标帜物.4.启关血浑与二抗根源动物普遍,尔用的是10%的仄常donkey血浑.5.其余步调共普遍免疫荧光单标支配.要领三:1.片子的创造:不妨搞细胞爬片,细胞甩片,另有间接正在24well/12well/96well中间接染色2.细胞爬片的创造:间接买买公司的已经处理过的细胞爬片,假如自己创造的话,便用无菌的盖玻片用多散好氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液匀称甩到玻片上.4.本去小的well的话,不妨间接拿去染色,出问题的.5.牢固:用PBS洗去培植液,用牢固液(如甲醇战丙酮;4%多散甲醛;酒粗...)牢固细胞.6.内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞(选做,二抗连HRP得必搞,其余的如搞免疫荧光染色不必搞).7.通透(胞浆蛋黑战细胞核蛋黑需要搞;细胞膜蛋黑不需要搞),普遍采用Triton-X100去搞细胞通透,浓度战时间需要摸索,普遍是0.1-5%,处理时间为1-30分钟,级各别需要到1-2小时.8.启关:洗去通透液,用二抗共源的血浑约10%的浓度inPBS中启关半小时,也不妨采用5-10%脱脂奶粉.启关中断后千万不要洗,间接上一抗.9.一抗:简曲您念搞什么样的蛋黑,接洽抗体公司如santacruze,Abcam,sigma.....采用简曲的抗体,然而是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液不妨买买抗体公司现成的,对付于新脚仍旧挺佳的.时间普遍是4度过夜大概者37度1小时.一抗最佳仍旧采用中国抗体公司的抗体.10.洗去一抗.11.上二抗,二抗普遍抗体公司会给您推荐的,您正在其中选上一个便止了,自己选国产的也止,便是选正在哪个动物体内搞的一抗,二抗便选抗那个动物的便止了.二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液战一抗相共便止了.二抗的时间普遍是37度半小时.12.底物隐色(选做,二抗连得是酶的必搞,按试剂盒的证明书籍增加便止了,隐色时间大概需要摸索,免得隐色过分引起假阳性;二抗连得是荧光报告的不必搞)13.洗去二抗,染核14.DAPI大概者Hoechst染核15.洗去染核液,加PBS,上镜瞅察.要领四:(1)细胞准备.对付单层死少细胞,正在传代培植时,将细胞接种到预先搁置有处理过的盖玻片的培植皿中,待细胞靠近少成单层后与出盖玻片,PBS洗二次;对付悬浮死少细胞,与对付数死少细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片体造备细胞片大概间接造备细胞涂片.(2)牢固.根据需要采用适合的牢固剂牢固细胞.牢固完成后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月.PBS洗涤3×5 min.(3)通透.使用接联剂(如多散甲醛)牢固后的细胞,普遍需要正在加进抗体孵育前,对付细胞举止通透处理,以包管抗体不妨到达抗本部位.采用通透剂应充分思量抗本蛋黑的本量.通透的时间普遍正在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.(4)启关.使用启关液对付细胞举止启关,时间普遍为30min.(5)一抗分离.室温孵育1h大概者4℃过夜.PBST漂洗3次,屡屡浑洗5min.(6)二抗分离.间接免疫荧光需要使用二抗.室温躲光孵育1h.PBST漂洗3次,屡屡浑洗5min后,再用蒸馏火漂洗一次.(7)启片及检测.滴加启片剂一滴,启片,荧光隐微镜查看.要领五:1.漂洗血浑蛋黑P,37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇牢固20分钟后,自然、搞燥 10分钟3.PBS洗洁:3min*34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗洁:2*5min6.羊血浑启关:37度,20分钟7.一抗,4度过夜,普遍要大于18小时大概者37度1-2小时8.4度PBS洗洁,3min*5次9.二抗37度小于一小时10.37度PBS洗洁,3*3min11.凉搞启片(启关液)细胞免疫荧光步调:1.细胞爬片;最先是玻片的处理,一般的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小圆块,先用洗衣粉洗搞洁,用火冲静烤搞,而后泡酸过夜,捞酸后流火洗洁,烤搞,置于器皿中下压灭菌,而后再烤箱中约莫8小时烤搞备用.爬片不妨正在培植皿六孔板大概24孔板中皆可,尔采用正在培植皿中爬.一为俭朴经费(培植皿不妨沉复利用)二去感触培植皿心大,支配比较便当.培植皿消毒共上,消毒时记得消二把镊子简曲支配是:用胰酶消化佳细胞,充分吹挨,使之成单细胞悬液(注意:那一面很要害,关系到将去爬出去片子的品量)与出消毒的培植皿,不妨先加少量培植基(以使玻片与培植皿稀切交战),将玻片留神搁进晃搁其中,而后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上.末尾盖上培植皿置于37度5%CO2的温箱中培植,根据细胞死少情景,24小时大概更万古间适时与出爬片.爬片置于37度PBS中洗三次,屡屡3到5秒钟,而后正在4%多散甲醛中牢固15分钟,而后再用37度去离子火将甲醛冲搞洁,注意脚法沉柔,要可则掉片很锋利.共时支配历程中注意玻片的正反里,要可则果然是前功尽弃.将搞佳的爬片置于滤纸上晾搞,而后用中性树胶粘正在载玻片上.注意一定要等中性树胶真足搞了之后才搞搞后绝真验,要可则玻片会掉下去的,便又是前功尽弃了搞佳的细胞爬片不妨搁正在-20保存备用,简曲能保存多万古间不太领会,天然尽管早用.2.4%多散甲醛牢固10min(牢固细胞器用预热的70%甲醇+30%丙酮);3.PBS漂洗5min;4.0.5% Triton 脱孔15min(丙酮牢固法不必透化处理);5.PBS漂洗2次,屡屡5min;6.1%BSA启关30min;7.加进1%BSA稀释的一抗,于37℃纯接2h;8.PBS漂洗2次,屡屡5min;9.加进1%BSA稀释的二抗,于37℃纯接1h;10.PBS漂洗2次,屡屡5min;11.5ug/ml DAPI染色2min;12.抗淬灭启片剂启片.抗淬灭启片剂:2.5% DABCO (w/v) 50mM Tris(pH8.0) 90%苦油细胞免疫荧光细胞爬片4%多散甲醛牢固10min(牢固细胞器用预热的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 脱孔15min(丙酮牢固法不必透化处理)PBS漂洗2次,屡屡5min1%BSA启关30min加进1%BSA稀释的一抗,于37℃纯接2hPBS漂洗2次,屡屡5min加进1%BSA稀释的二抗,于37℃纯接1hPBS漂洗2次,屡屡5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭启片剂启片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭启片剂 50mM Tris(pH8.0)90%苦油0.25g DABCO9ml苦油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解,-20℃保存0.5ml ddH2O。

crt细胞免疫荧光步骤

crt细胞免疫荧光步骤

crt细胞免疫荧光步骤CRT细胞免疫荧光步骤引言:CRT细胞免疫荧光是一种常用的实验方法,用于研究细胞内钙离子调控与荧光素酶活性的关系。

本文将详细介绍CRT细胞免疫荧光的步骤,以帮助读者更好地理解和应用这一实验方法。

一、材料和试剂准备1. 细胞培养基:含有适当浓度的培养基,如DMEM或RPMI 1640。

2. 细胞系:根据实验需要选择合适的细胞系,如HEK293或HeLa 细胞。

3. 荧光素酶底物:根据实验需要选择合适的荧光素酶底物,如Luciferin或D-Luciferin。

4. 荧光素酶缓冲液:含有适当浓度的荧光素酶缓冲液,如PBS或Tris缓冲液。

5. 甲醛:用于固定细胞。

6. 渗透剂:如Triton X-100。

二、细胞处理和固定1. 细胞培养:将细胞培养在含有适当浓度的培养基的培养皿中,保持在适当的培养条件下(如37°C,5% CO2)。

2. 细胞处理:根据实验需要,处理细胞,如给予刺激或处理药物。

3. 细胞固定:将培养皿中的培养基倒掉,加入适量的甲醛固定细胞,固定时间根据实验需要而定,一般为10-30分钟。

三、细胞膜的渗透和荧光素酶底物的加入1. 渗透处理:在细胞固定后,用适量的渗透剂(如Triton X-100)处理细胞,以促进荧光素酶底物的渗透。

2. 荧光素酶底物的加入:将适当浓度的荧光素酶底物溶液滴加到处理后的细胞上,使其充分覆盖。

四、观察和分析1. 荧光成像:将处理后的细胞放置在荧光显微镜下观察,并进行荧光成像。

调整合适的曝光时间和荧光通道以获取清晰的图像。

2. 分析荧光强度:使用图像分析软件或荧光显微镜系统,对荧光图像进行分析,包括荧光强度、荧光分布和荧光定位等。

五、结果解读和讨论1. 结果解读:根据荧光成像和分析结果,解读细胞内钙离子调控和荧光素酶活性的关系,得出相应的结论。

2. 讨论和展望:对实验结果进行讨论,与已有文献进行比较,提出可能的机制和研究方向,展望未来的研究。

三种细胞免疫荧光染色操作步骤

三种细胞免疫荧光染色操作步骤

三种细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合,其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗,荧光显微镜下即可观察到荧光,下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光,步骤如下:1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时,从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次,每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次,每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次,每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4度过夜9、1×PBS洗3次,每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟,闭光11、1×PBS洗3次,每次10分钟12、95%甘油封片注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。

注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小,因此夹取的时候要小心,注意反正面,放在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加PBS不要太冲,不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟,PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟,PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜,也可37度2小时,感觉前者效果好,PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时,PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核,然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因为甘油不象树脂那样会干,所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

免疫荧光检测步骤

免疫荧光检测步骤

免疫荧光检测步骤
免疫荧光检测是一种用于检测生物样本中特定蛋白质或分子的技术。

以下是一般免疫荧光检测的基本步骤:
1. 样本准备:根据实验需求,准备适当的细胞、组织或切片样本。

确保样本的质量和保存条件符合要求。

2. 固定和通透:使用适当的固定剂(如多聚甲醛)固定样本,以保持样本的形态和结构。

对于细胞或组织样本,可能需要进行通透处理,以使抗体能够进入细胞内部。

3. 抗原修复:对于某些样本,可能需要进行抗原修复步骤,以暴露被掩盖或隐蔽的抗原表位。

4. 封闭:使用非特异性蛋白或血清封闭样本,以减少非特异性结合。

5. 一抗孵育:选择适当的一抗,将其稀释到适当的浓度,并与样本一起孵育,使一抗与目标抗原结合。

6. 洗涤:孵育后,用缓冲液洗涤样本,以去除未结合的一抗。

7. 二抗孵育:选择与一抗种属匹配的荧光标记二抗,将其稀释到适当的浓度,并与样本一起孵育,使二抗与一抗结合。

8. 洗涤:再次用缓冲液洗涤样本,以去除未结合的二抗。

9. 荧光显微镜观察:将样本置于荧光显微镜下,选择适当的激发波长和滤光片,观察荧光信号的分布和强度。

10. 图像分析:根据需要,可以使用图像分析软件对荧光图像进行分析和定量。

需要注意的是,免疫荧光检测的具体步骤可能因实验目的、样本类型和所使用的抗体而有所差异。

在进行实验之前,建议仔细阅读相关的实验方案和操作指南,并根据实际情况进行适当的调整和优化。

免疫荧光染色实验步骤

免疫荧光染色实验步骤

免疫荧光染色实验步骤1.细胞处理:将需要进行染色的细胞培养于培养皿中,通常使用生理盐水或PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤细胞,以去除培养基或其它细胞残留物。

2.固定:使用适当的固定剂,如甲醛或乙醛,固定住细胞。

通常在室温下固定细胞10-30分钟,然后用PBS洗涤。

3.渗透化处理:为了增强抗原与抗体的结合,需要使用渗透化剂如BSA(牛血清白蛋白)或胎牛血清等,封闭其它非特异结合位点。

浓度通常为1-5%的BSA,可以根据实验需要调整。

4.预处理:通过预处理,可以增强抗原的可见性。

预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。

具体方法应根据需要选择。

5.抗原特异性溶液:将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养皿中,使其与抗原结合。

抗体通常与标记物如荧光染料共价结合,使得标记的抗原能够被荧光显微镜观察。

6.清洗:将细胞用PBS洗涤,以去除未与抗体结合的游离抗体。

7.荧光显微镜观察:使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。

荧光显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片,可以选择和激发不同荧光染料的发光。

根据需要,可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。

8.影像分析:通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进行分析和量化。

常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。

9.结果解读:根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。

可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。

补充说明:2.正、阴对照:在进行抗原染色前,应设置正、阴对照实验。

正对照是指使用已知表达目标抗原的样本,而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。

通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。

3.染色条件优化:染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。

因此,需要对染色条件进行优化,以确保得到准确的结果。

4.扩展检测:除了直接染色,还可以使用间接染色方法来增强信号。

通过使用辅助抗体,可以将多个标记物同时进行检测,提供更多的信息。

总结起来,免疫荧光染色实验步骤是:细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。

四种抗体免疫荧光染色操作步骤

四种抗体免疫荧光染色操作步骤

四种抗体免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色听起来就很厉害的样子呢,其实操作起来也没有特别难啦。

一、样本准备。

咱得先把要染色的样本处理好哦。

如果是细胞样本的话,要把细胞好好地培养在载玻片或者盖玻片上,让它们长得美美的,可不能有太多杂质或者状态不好。

要是组织样本呢,就得把组织切成薄片,这个切的时候可得小心啦,就像对待小宝贝一样。

二、固定。

固定这个步骤超重要的。

一般用多聚甲醛来固定样本,把样本泡在里面一段时间,就像给细胞或者组织来个“定身术”,让它们保持原来的样子,这样后面染色的时候才不会变形。

这个时间要掌握好哦,太久或者太短都不太好。

三、通透。

接下来就是通透啦。

用一些通透剂,像Triton X - 100之类的,让抗体能够顺利地进入细胞里面去找到它们要结合的目标。

这就像是给抗体开了个小通道,让它们能自由穿梭。

四、封闭。

封闭就像是给样本穿上一层保护衣。

用正常血清或者牛血清白蛋白之类的东西把样本上那些非特异性结合的位点给占住,这样抗体就不会乱结合啦,只会乖乖地去找自己的目标。

五、一抗孵育。

现在轮到一抗上场啦。

把我们准备好的四种抗体按照合适的比例稀释好,然后加到样本上。

这个时候样本就像是一个小舞台,一抗们就开始在上面寻找自己的舞伴(抗原)啦。

孵育的时间也要注意,要让它们有足够的时间去结合。

六、洗涤。

一抗孵育完了,就得把没结合上的一抗给洗掉,就像打扫舞台一样,只留下那些成功结合的一抗。

用缓冲液轻轻冲洗样本,多洗几次,这样才能保证后面的结果准确。

七、二抗孵育。

二抗是带着荧光标记的哦。

把二抗按照比例稀释后加到样本上,二抗就会去找一抗,然后紧紧地抱住它。

这时候就像给一抗穿上了一件会发光的衣服,超酷的。

八、再次洗涤。

和之前一样,把多余的二抗给洗掉,让舞台又变得干干净净的。

九、封片。

最后一步就是封片啦。

用封片剂把样本封起来,这样样本就可以好好保存,等着我们去观察它在荧光显微镜下的美丽模样啦。

免疫荧光染色就这么一步步来,每一步都很关键,就像搭积木一样,少了一块都不行呢。

体外细胞免疫荧光染色

体外细胞免疫荧光染色

体外细胞免疫荧光染色
体外细胞免疫荧光染色是一种利用荧光标记技术对细胞中的特定蛋白质、抗原、细胞器等进行检测和定位的方法。

以下是其基本步骤:
1. 细胞或组织样品的固定:通常使用甲醛或乙醛来固定细胞或组织,以保持其形态和蛋白质结构的完整性。

2. 抗体的孵育:将特异性抗体加入到样品中,与目标蛋白质结合。

3. 洗涤:用缓冲液洗去未结合的抗体。

4. 二抗的孵育:加入荧光标记的二抗,与原抗体结合。

5. 洗涤:用缓冲液洗去未结合的二抗。

6. 荧光显微镜观察:使用荧光显微镜观察样品,荧光信号可显示目标蛋白质的位置和分布。

在免疫荧光染色中,选择特异性和效价更高的抗体非常重要,同时要注意调整一抗和二抗的稀释比例。

荧光染料的选择也很关键,如异硫氰酸(FITC)呈翠绿色荧光,四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)呈橙红色荧光,四乙基罗丹明(RB200)也呈橙红色荧光等。

细胞免疫荧光染色

细胞免疫荧光染色

细胞免疫荧光染色细胞免疫荧光染色1.盖玻片处理:用前1天用纱布擦净灭菌,放入6孔板。

2.接种细胞:较低密度为适宜,约2000-10000个/孔(根据细胞生长状态决定,常用5000个/孔),2ml(浓度为2500/ml)3.24h后细胞贴壁,根据需要同步16-18h,干预处理,细胞融合60-70%时染色最佳4.37度PBS洗涤,3ml/孔,贴边加(可将6孔板倾斜,加完样在放正以防冲掉细胞,0.5min。

室温PBS也可,但4度禁止,否则细胞易皱缩。

5.固定:4%多聚甲醛(1ml),先常温稳定5min,然后4度,10min,(可放在饭盒内)。

6.吸掉多聚甲醛,迅速加PBS 5ml/孔,洗涤5min×3次,镜下观察,细胞形态如前。

7.透化:0.1%-4%triton×-100,1ml/孔,室温透化5min (triton是去污剂,目的是将脂质成分破坏,如细胞膜、核膜等,故不影响实验结果,可不用洗涤)8.5%BSA(滤过)室温封闭至少20min(可配制含5%BSA和0.2%triton的混合液,将两步合成一步)风干9.用5%BSA将一抗1:50或1:100(常用)稀释至EP管200ul/玻片10.将纱布垫在饭盒中,去离子水润湿纱布,准备封口膜。

11.吸去BSA,迅速滴加一抗,从玻片1中央滴加,液体会自行扩散至全片。

为保持细胞湿润,将6孔板封好,放入饭盒,37度孵育1-2h(有利于抗体结合),再室温3-4h。

(或室温2h后,4度过夜)注意勿晃动6孔板,防止抗体不均或从玻片洒出。

12.PBS洗涤10min*3次(可用western的摇床)13.用5%BSA将二抗1:50稀释(得到的实际浓度为1:100,因二抗本身已经被甘油稀释1倍),也可1:200稀释。

室温1.5h后可显荧光(放在饭盒里,避光)14.PBS洗涤10min*3次(可用western的摇床)15.免疫荧光显微镜观察。

泡在2ml的PBS中保存。

细胞免疫荧光实验原理

细胞免疫荧光实验原理

细胞免疫荧光实验原理
细胞免疫荧光实验是一种常用的技术手段,用于研究特定分子在细胞中的位置和分布情况。

该实验基于免疫荧光染色原理,利用荧光标记的抗体或其它特异性标记物,绑定到目标分子上,并利用荧光显微镜观察荧光信号的分布情况。

细胞免疫荧光实验的基本步骤包括:
1. 固定细胞:将要研究的细胞进行固定处理,常用的固定剂包括甲醛、乙醛等。

固定细胞的目的是保持细胞形态和防止细胞膜的破裂。

2. 渗透处理:细胞具有完整的细胞膜,为了使抗体或标记物能够穿透细胞膜与目标分子结合,需要进行渗透处理。

常用的渗透处理方法包括使用洗涤剂(如0.1% Triton X-100)或酶(如胰蛋白酶)等。

3. 阻断非特异结合:为了避免非特异性结合,需要使用一定的阻断剂。

常用的阻断剂包括牛血清蛋白(BSA)等。

4. 抗体处理:将特异性抗体或标记物加入到样品中,使其与目标分子发生特异性结合。

抗体可以选择荧光标记的一抗或二抗,也可以选择其他特定标记的抗体,如荧光素酶(HRP)标记的抗体。

5. 洗涤:为了去除未结合的抗体或标记物,需要进行多次洗涤步骤。

洗涤的目的是减少非特异性结合,提高信号与噪音比。

6. 荧光显微镜观察:使用荧光显微镜观察荧光信号的分布情况。

荧光显微镜具有高度灵敏度和分辨率,能够观察到细胞内特定分子的位置和分布情况。

细胞免疫荧光实验的原理是基于特异性抗体与目标分子的结合,并利用荧光标记物的荧光信号来检测目标分子的位置和分布。

通过该实验,可以了解细胞内特定分子的表达情况、定位以及相互作用等重要信息。

24孔板细胞免疫荧光步骤

24孔板细胞免疫荧光步骤

24孔板细胞免疫荧光步骤24孔板细胞免疫荧光步骤是一种广泛建立在细胞和分子生物学领域的实验技术,用来检测细胞中特定蛋白质的表达和定位。

下面将介绍24孔板细胞免疫荧光步骤的详细内容。

1. 细胞培养和处理:首先,选择合适的细胞系进行实验,并将其培养在含有适当培养基的培养皿中。

在培养过程中,要注意细胞的数量和健康状态。

2. 干扰处理:根据具体实验设计的需要,可以对细胞进行干扰处理,例如使用siRNA沉默目标基因,或者利用药物处理细胞。

这一步是为了研究目标蛋白质在不同条件下的表达和功能。

3. 细胞固定:用适当的方法将细胞固定在培养皿中,常见的方法有使用甲醛或乙酸乙酯等化学固定剂进行固定,也可以用冷冻固定等方法。

固定的目的是保留细胞结构和蛋白质的空间位置信息。

4. 渗透处理:为了使抗体能够渗透到细胞内部并与目标蛋白质结合,需要对细胞进行渗透处理。

常用的渗透剂有0.1% Triton X-100或0.5% Tween-20等,可以使细胞膜通透性增加,从而使得抗体能够进入细胞内。

5. 阻断处理:为了避免非特异性结合,需要对细胞进行阻断处理。

常见的阻断剂有1%牛血清白蛋白(BSA)或3%牛血清等,可以减少背景信号的干扰。

6. 抗体孵育:在细胞上加入特异性的一抗,让其与目标蛋白质结合。

一抗的选择应根据具体试验目的和蛋白质特性来定,常见的抗体类型有单克隆抗体和多克隆抗体。

孵育时间和温度需依据抗体性能和制造商建议进行确定。

7. 洗涤:使用适当的缓冲液对细胞进行洗涤,以去除非特异性结合的抗体。

一般进行3次洗涤,每次洗涤时需使用足够的缓冲液,各洗涤时间一般为5-10分钟。

8. 二抗孵育:加入与一抗来源物种不同的二抗,使其与结合在细胞上的一抗发生特异性结合。

二抗经常与荧光物质结合,从而能够产生荧光信号。

9. 洗涤:同样进行3次洗涤,去除非特异性结合的二抗。

10. 荧光显微镜观察:将细胞转移到荧光显微镜中观察,荧光显微镜能够通过激发特定波长的荧光物质,观察目标蛋白质的定位和表达水平。

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细胞免疫荧光:取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液。

将细胞接种到24孔板中,置5%C02培养箱培养1天,待细胞接近长成单层,取出孔板,4%多聚甲醛37℃,固定30min,含1%Triton X-l00的PBS溶液37℃作用30min增加细胞膜的通透性,非免疫动物血清37℃封闭40分钟,吸净血清后分孔做好标记加入抗体(1:100),4℃湿盒过夜,次日预冷的PBS溶液冲洗5分钟×3次后避光加入分别相应的荧光标记二抗(1:50),加入异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)(绿色)标记的二抗(1:50)置湿盒内,避光37℃,孵育30分钟,PBS冲洗5分钟×3次后,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(1:1000)避光37℃复染细胞核20分钟。

PBS冲洗5分钟×3次后,使用倒置荧光显微镜(TE2000,NIKON)观察成像。

阴性对照用PBS代替一抗,其余步骤同实验组相同。

1%Triton X-l00所起的作用应该是溶解膜上的脂质分子,从而增加膜的通透性,使抗体容易进入细胞。

一般30min足以,如果是核内蛋白,可以适当增加时间。

目的蛋白是NFKBp65,检测它在乳腺癌MDAMB231细胞里的核转位情况,我用的一抗二抗都是CST的,我用的步骤是
1 甲醇-20度固定5分钟(建议用4%多聚甲醛固定,使用多聚甲醛前(因为一般配好的多聚甲醛都放在4度冰箱内避光保存)平衡至室温再用,否则细胞会遇冷收缩,形态发生改变。

不需要透膜。


2 pbs-0.2﹪triton漂洗3次,pbs-1﹪triton破膜15分钟,然后再洗三次洗涤液同上
3 5﹪BSA封闭1h
4 一抗1:100 4度孵育了近20小时,然后洗三次
5 二抗1:150避光室温1h
免疫荧光第一步的步骤几注意事项
1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.
2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片
3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化.
4. 不知道你的一抗是在胞浆表达还是在胞核表达
如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟
5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液.
6. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.
7. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失.
注意,PBS液的PH值要调在7.4左右
免疫荧光第二步的步骤及注意事项
1. 等抗体孵育过后,取出洗片,这是要注意不要把不同抗体的片子混在一块了(比如冲洗玻片的吸头要一对一,冲完一种抗体后要去掉,换另一个再冲)
2. 洗后自然晾干,加荧光二抗(一般这也要摸个浓度,并不能按部就班地照着说明书上稀释),室温孵育45-60分钟,注意要避光,虽说荧光除非再紫外灯下才会淬灭的快,但操作时还是要注意避光
3. PBS洗,洗的时候还是要注意避光
4. 洗后自然晾干,加第二种荧光探针(我做的是一抗在胞浆表达,加第二种荧光谈针是染核,这样便于计数)孵育10-15分钟,避光条件下作用,洗片时也要避光.
5. 自然晾干后,50%缓冲甘油封片.
常见问题分析:
背景强,有可能1、玻片是否处理得当;2、洗片没洗干净;3、洗片用的PBS很脏;4、抗体用前没有稍离心,离心过后取上清进行稀释;5、用的荧光二抗浓度太高,并不是说坑体浓度高就会增强荧光,相反,会增加背景染色。

还有就是二抗得质量问题。

抗体淬灭得太快有可能1、操作过程中未避光(可能性不是很大),2、二抗稀释不当(太稀了),3、二抗质量存在问题,SIGMA公司(博士得公司分装)的Cy3,荧光很强,做出的图片很漂亮。

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