基因克隆
基因克隆原理
基因克隆原理基因克隆是指将一个细胞中的基因复制到另一个细胞中的过程。
基因克隆技术的发展为生物学研究和生物医学应用提供了重要的工具。
在基因克隆的过程中，有一些基本的原理和步骤是必须要了解的。
首先，基因克隆的原理是利用DNA重组技术将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA中，然后将这个重组的DNA导入到宿主细胞中进行复制。
这个过程涉及到DNA的分离、切割、连接和导入等一系列复杂的操作。
其中，DNA的分离和切割是基因克隆中的关键步骤。
DNA的分离是通过酶切技术实现的。
酶切是利用特定的内切酶在DNA的特定位置上进行切割，产生特定的DNA片段。
这些DNA片段可以是感兴趣的基因，也可以是载体DNA。
通过酶切，我们可以将感兴趣的基因和载体DNA进行分离。
接下来是DNA的连接。
在DNA的连接中，我们需要利用DNA连接酶将感兴趣的基因和载体DNA进行连接。
这个过程需要特定的连接酶和适当的条件来进行，以确保连接的有效性和稳定性。
然后是DNA的导入。
在DNA的导入中，我们需要将重组的DNA导入到宿主细胞中。
这个过程可以通过转染、转化或者病毒介导等方法来实现。
一旦DNA成功导入到宿主细胞中，它就会被宿主细胞复制和表达，从而实现基因的克隆。
基因克隆的原理虽然看起来复杂，但是实际操作起来并不困难。
随着生物技术的发展，基因克隆技术已经得到了广泛的应用。
例如，基因克隆技术可以用于生产重组蛋白、制备转基因植物、研究基因功能等方面。
它为生物学研究和生物医学应用提供了重要的工具和手段。
综上所述，基因克隆的原理是利用DNA重组技术将感兴趣的基因插入到载体DNA中，然后将这个重组的DNA导入到宿主细胞中进行复制。
这个过程涉及到DNA的分离、切割、连接和导入等一系列复杂的操作。
基因克隆技术的发展为生物学研究和生物医学应用提供了重要的工具，它已经得到了广泛的应用，并为生物学研究和生物医学应用提供了重要的工具和手段。
基因克隆的技巧
基因克隆的技巧
基因克隆是生物学研究中常用的技术之一，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
以下是基因克隆的一些常见技巧：
1. DNA提取：从源生物体中提取目标基因的DNA。
常见的方法包括溶解细胞膜、蛋白质降解和碱解。
2. 剪切和黏贴：利用限制酶（也称为内切酶）剪切目标DNA，并在相应的酶切位点上黏合连接，形成重组DNA。
3. DNA扩增：通过聚合酶链式反应（PCR）或其他扩增方法，复制目标DNA 片段，以获得足够数量的DNA进行后续实验。
4. 重组载体构建：将目标DNA插入载体DNA，形成重组载体。
载体可以是质粒、噬菌体或其他类型的DNA。
常见的方法包括限制酶消化和连接、启动子和终止子的选择，以及DNA酶切和黏接。
5. 转化：将重组载体导入宿主细胞。
常见的方法包括化学法、电穿孔法和基因枪法。
6. 筛选：使用适当的筛选标记（例如抗生素抗性基因）鉴定并筛选成功转化的细胞。
7. 分离和培养：分离并培养选出的转化细胞，以获得包含目标基因的克隆。
这些技巧在基因克隆中被广泛使用，但具体的操作和条件可能会因实验需求和研究对象而有所不同。
基因克隆技术名词解释
基因克隆技术名词解释基因克隆技术是指通过人工手段将一个生物体的基因从其源生物体中抽取并插入到另一个宿主生物体中的过程。
以下是一些基因克隆技术的常见术语的解释：1. DNA复制（DNA replication）：在细胞分裂或基因克隆过程中，DNA的双链被解开，通过酶的作用，在每个单链上合成一条新的互补链，从而产生两条完全相同的DNA分子。
2. 基因库（gene library）：基因库是一个储存基因序列的集合，通常通过将DNA分子从一个组织或生物提取出来，并将其插入到载体（如细菌或酵母）中来构建。
3. 重组DNA技术（recombinant DNA technology）：重组DNA技术是一种通过将不同来源的DNA片段连接到一起来生成新的DNA分子的方法。
这种方法可用于将特定基因插入宿主生物体的基因组中。
4. 基因放大（gene amplification）：基因放大是指通过体外复制方法制备大量特定DNA序列的过程，如聚合酶链式反应（PCR），从而获得足够量的DNA来进一步研究。
5. 基因表达（gene expression）：基因表达是指基因通过转录和翻译的过程产生功能性蛋白质的过程。
基因克隆技术可以用于将外源基因（来自其他物种）插入宿主生物体的基因组中，从而使宿主生物体表达该基因及其编码的蛋白质。
6. 表达载体（expression vector）：表达载体是一种DNA分子，其中包含了一个外源基因的表达序列，如启动子、转录终止子和转录调控元件等。
表达载体可以在宿主生物体中将外源基因表达出来。
7. 选择标记（selection marker）：选择标记是一种用于帮助筛选转化成功的宿主生物体的方法。
常用的选择标记包括耐抗生素基因，只有含有特定基因的宿主生物体才能在含有相应抗生素的培养基中生长。
8. 基因敲除（gene knockout）：基因敲除是指通过特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）来使宿主生物体中的特定基因失去功能。
基因的克隆方法大全
1.2.3 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕
最先由Liang等于1992年报道,目前已广 泛在实验室使用.
主要LY〔A〕结构,在其3`端设计象5`-
T11GA样引物,该引物可与mRNA总数的
十二分之一结合,从而使这部分基因得到
逆转录,同时结合5`端的随机引物〔20条
染色体 T-DNA
染色体 目的基因野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析2，4 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因 子,实际上也是DNA片段,它可以在生 物的染色体组中移动,从染色体的一个 位点跳到另一个位点,或从一条染色体 跳到另一条染色体上,引起基因功能的 改变.
8
已发展的相应基因克隆方法：
差减杂交〔SH〕 抑制性差减杂交〔SSH〕 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕 DNA代表性差异分析〔DNA RDA〕 扩增限制性片段长度多样性〔AFLP〕 cDNA微阵列
9
差减杂交〔SH〕
最早由Lamar和Palmer于1984年提 出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究.
10-mer〕,可m以RN使A不同长度的基因得到扩
增5. `
RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT
ACTTTTTTTT
AGTTTTTTTT
TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT
41
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
基因克隆的概念
基因克隆的概念基因克隆是指以细胞或生物体为基础，通过人工手段复制出与原始生物体完全相同的基因组和基因表达的过程。
它是利用现代生物技术和分子生物学技术，通过人工手段将一个或多个基因从一个物种的生物体中提取并复制到另一个物种的生物体中，从而在目标生物体中表达出与原始基因相同的特性和功能。
基因克隆的过程可以分为五个主要步骤：DNA提取、DNA切割、DNA连接、DNA转化和筛选。
首先，进行DNA提取。
DNA可以从目标生物体的组织样品中提取，通常使用聚合酶链式反应(PCR)或限制酶切技术来放大和获取所需的基因片段。
接下来，进行DNA切割。
使用一种特殊的酶，即限制酶，可以将特定的DNA 序列切割成片段，从而得到所需的基因片段。
然后，进行DNA连接。
在连接过程中，将目标基因片段插入到载体DNA中，形成重组DNA。
常见的载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等，它们可以用于将基因片段转移至目标生物体中。
接着，进行DNA转化。
将重组DNA导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
常使用细菌或酵母等微生物作为宿主细胞。
最后，进行筛选。
通过筛选方法来鉴定带有目标基因的宿主细胞，如选择性培养基、荧光标记等。
这样就可以筛选出目标基因在宿主细胞中稳定复制和表达的克隆。
基因克隆的应用非常广泛。
在农业领域，基因克隆可以用于制造具有抗虫、抗病、抗逆境等特性的转基因作物；在医学领域，基因克隆可以用于合成药物、生产重组蛋白和生物材料等；在基础科学研究中，基因克隆可以用于分析基因功能、研究疾病机制等。
然而，基因克隆也存在一定的问题和争议。
首先，基因克隆技术涉及到伦理和道德问题。
由于基因克隆涉及到对生命进行人工干预，引发了关于对生命是否应当加以个体尊重和保护的争议。
其次，基因克隆过程中可能发生不确定的突变和不稳定的基因表达，导致不可预测的副作用和潜在风险。
此外，一些人担心基因克隆可能导致基因多样性的减少，进而影响生物体的适应性和生存能力。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
基因克隆原理
基因克隆原理基因克隆是指将一个生物体的基因（DNA）复制到另一个生物体中的过程。
基因克隆技术的发展为生物学研究和医学应用带来了巨大的进步，也为我们更好地理解基因的功能和调控提供了重要手段。
下面，我们将详细介绍基因克隆的原理。
首先，基因克隆的第一步是获得目标基因的DNA序列。
这可以通过多种方法实现，例如从细胞中提取DNA，或者利用PCR技术扩增目标基因的特定片段。
获得目标基因的DNA序列是基因克隆的关键步骤，它为后续的操作奠定了基础。
接下来，获得的DNA序列需要被插入到载体DNA中。
载体DNA通常是一种可以自我复制的DNA分子，常用的载体包括质粒和病毒。
将目标基因的DNA序列插入到载体DNA中需要利用特定的酶（如限制酶和连接酶）进行操作，确保目标基因能够被稳定地携带和复制。
一旦目标基因被成功插入到载体DNA中，接下来就是将这个重组的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转染、转化或注射等方式实现。
一旦目标基因被成功导入宿主细胞，它就会被宿主细胞的生物机制识别并开始表达，从而产生目标蛋白或表型。
基因克隆的原理可以简单概括为，获得目标基因的DNA序列、插入到载体DNA中、导入宿主细胞并表达。
这个过程需要利用多种酶、载体和实验技术，因此在实践中需要严谨的操作和精密的设计。
总之，基因克隆技术的原理虽然复杂，但其核心思想是将目标基因从一个生物体转移到另一个生物体，并使其在新的宿主中表达。
基因克隆技术的发展为我们提供了研究基因功能、生物学机制以及治疗疾病的重要手段，相信随着技术的不断进步，基因克隆技术将在更多领域展现出其巨大的应用潜力。
目的基因的克隆方法
目的基因的克隆方法
1. 直接克隆法呀，这就好比你直接去商店挑了一个你最喜欢的玩具，简单又直接！比如说，我们想克隆某个特定基因，就像你一眼看中那个可爱的小熊玩偶，直接把它拿过来就行啦。
2. 还有反转录克隆法哦，哎呀，就好像把一段声音录下来再倒放出来一样神奇！比如从细胞中的 mRNA 反转录得到 cDNA，不就是很有趣的过程嘛？
3. 载体介导克隆法呢，就好像给基因找了一辆专门的车来运输它！像把基因放到特定的载体里，让它顺利到达目的地。
4. 基因文库筛选法呀，哇，这就像是在一个超级大的宝库中找宝贝！比如说在庞大的基因文库中去努力找到我们想要的那个目的基因。
5. PCR 扩增克隆法哟，这就跟变魔术一样厉害呢！比如通过 PCR 技术把特定基因大量扩增出来，好神奇呀！
6. 杂交捕获克隆法，哈哈，就好像用一个小陷阱去抓住我们想要的基因！像是专门设计来抓住目标基因一样。
7. cDNA 末端快速扩增法，这不就像是跑步冲刺一样快速到达终点嘛！像快速扩增 cDNA 的末端，得到我们要的基因片段。
8. 人工合成克隆法，哇塞，这可真牛，就像自己动手做一个超级厉害的东西出来！比如人工合成一些小的基因片段呢。
9. 染色体步移克隆法，嘿嘿，就好像一步一步探索一个神秘的地方一样！像是沿着染色体逐步找到我们的目的基因。
我觉得这些目的基因的克隆方法都超级有趣，各有各的神奇之处呀！真的是让我们对基因世界的探索更加丰富多彩了呢！。
基因克隆
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是重 组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
四、体外重组的策略
1、粘末端连接
1）全同源粘末端连接
• 最方便简单
• 高背景-载体自身环化 • 双向插入
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
4、原核生物中功能相关的基因串联在 一起，形成操纵子。
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
• 原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。 • 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。 • 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因
分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌 至胞周间隙
（一）融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
融合型表达载体
融合基因
技术关键：克隆基因插入原核序列3’端 而维持正确阅读框架。 • 选择合适酶切位点
• 加人工合成的DNA接头
• 构建位相载体
载体部分序列
EcoRI BamHI
----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT ------TAC -----TTG GAC CTT AAG 、不同组织的cDNA不相同• 基因总量少，易筛选
4、PCR扩增目的基因片段
• 适用于克隆序列清楚的基因
• 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩 增较难 • 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因
基因克隆
基因克隆的方法基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义DNA段同能够自我复制的载DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA 技术。
根据这个定义，于是选择和使用不同的方法，最后得到含有目的基因片段的菌株。
针对目的基因的来源不同，可以选择多种克隆方法，但并没有放之四海而皆准的方法，要针对自己的目的基因的特点采取相应的且合适准确的方法来获得目的基因的克隆。
1当目的基因的序列完全已知时。
则可以根据文献上所查到的基因的注册序列号到相应的网上数据库去查找该基因的全序列结构信息，例如最常用的美国NCBI网站上的Genbank数据库。
然后查找到相应的目的基因的核苷酸序列信息和其来源。
然后使用生物信息学软件对基因的序列进行分析，设计通过PCR反应来扩增目的基因的核苷酸引物，并将设计的引物序列发给生物技术公司合成，最后得到引物核苷酸并用纯水进行合理的稀释。
接下来将采集含有目的基因的生物标本材料，使用合理的方法提取生物标本的基因组并进核酸浓度与纯度的测定，由于生物体的核酸从化学性质上来讲主要分为DNA和RNA两种，所以提取基因组后针对基因组的选择要尽可能去除另一种核酸的干扰与污染。
然后根据基因组的质量，浓度，PCR扩增设计引物的结构，目的基因的长度等因素设计PCR反应的条件，反复试验以找到能够通过PCR方法来准确扩增目的基因的最佳反应条件。
在目前的PCR反应中所采用工具酶为Taq DNA聚合酶，通常所用的Taq DNA聚合酶具有一个生物反应特性，在其扩增的PCR产物上，其3’末端总是会带有一个非模板依赖性的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A( dATP), 因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性，故可以针对这一点采取两种克隆策略。
其一，可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接；其二，可直接与一些T载体（切口处含有一个突出T碱基的克隆载体）连接并克隆。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告一、实验目的本次基因克隆实验的主要目的是从特定的生物体中获取感兴趣的基因，并将其插入到合适的载体中，以便进一步研究该基因的功能、表达和应用。
二、实验原理基因克隆是指通过一系列分子生物学技术，将一个目的基因从其所在的基因组中分离出来，并在体外进行扩增和修饰，然后将其连接到一个能够自我复制的载体分子上，形成重组 DNA 分子，最后将重组DNA 分子导入到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中稳定遗传和表达。
基因克隆的基本步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、目的基因与载体的连接、重组 DNA 分子的转化、重组子的筛选和鉴定等。
三、实验材料和试剂（一）实验材料1、含有目的基因的生物体样本，如细菌、植物或动物组织。
2、宿主细胞，如大肠杆菌。
（二）实验试剂1、限制性内切酶、DNA 连接酶。
2、聚合酶链式反应（PCR）所需的试剂，包括引物、dNTPs、Taq 聚合酶等。
3、琼脂糖、电泳缓冲液。
4、质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒。
5、抗生素，如氨苄青霉素。
四、实验步骤（一）目的基因的获取1、设计引物根据目的基因的序列，设计一对特异性引物。
引物的设计要考虑到引物的长度、GC 含量、Tm 值等因素，以确保引物能够有效地与目的基因结合，并在 PCR 反应中扩增出目的基因。
2、 PCR 扩增目的基因以生物体样本的基因组 DNA 为模板，进行 PCR 反应。
PCR 反应体系包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq 聚合酶和反应缓冲液。
PCR 反应条件包括预变性、变性、退火和延伸等步骤，通过多个循环的扩增，得到大量的目的基因片段。
（二）载体的选择和制备1、选择合适的载体根据实验目的和宿主细胞的特点，选择合适的载体。
常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
本实验中选择质粒作为载体。
2、制备线性化载体使用限制性内切酶对载体进行酶切，使其成为线性化的载体，以便于与目的基因进行连接。
（三）目的基因与载体的连接1、回收目的基因和线性化载体使用 DNA 凝胶回收试剂盒，分别回收 PCR 扩增得到的目的基因片段和线性化的载体片段。
基因克隆简介
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把 两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 基因克隆简介
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
限制性内切酶
能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来 DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称 为限制性核酸内切酶。
基因克隆简介
1.2、限制性核酸内切酶的命名原则
限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案， 即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母 ，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头 2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4 个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同 限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。
基因克隆简介
基因克隆简介
一. DNA分子克隆的基本原理
❖ 基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组 ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源 的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合 分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成 大量的子代DNA分子的过程。
❖ 克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性 繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性 繁殖系的过程(cloning)。
基因克隆简介
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤
❖ １.获得待克隆的DNA片段（基因）； ２.目的基因与载体在体外连接； ３.重组DNA分子导入宿主细胞； ４.筛选、鉴定阳性重组子； ５.重组子的扩增与／或表达。
基因克隆简介
➢ 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因 的DNA片段。
基因克隆的原理
基因克隆的原理
基因克隆是指通过重组DNA分子来复制或复制特定基因的过程。
它的原理涉及利用DNA重组技术从一个生物体中提取目
标基因，并将其插入到另一个宿主生物体的基因组中。
以下是基因克隆的基本原理和步骤：
1. 提取目标基因：从一个生物体的DNA中提取目标基因。
这
可以通过多种方法实现，如聚合酶链式反应（PCR）或酶切和连接技术。
2. 槽融合：使用合适的酶将目标基因与质粒DNA或其他载体DNA相连接。
这些质粒DNA通常是经过改造的DNA分子，
包含有关目标基因的所需信息，如启动子、激活子和选择性标记。
3. 转化宿主细胞：将重组质粒DNA导入到宿主细胞中。
这可
以通过多种方法实现，如电穿孔、化学转化或基因枪。
宿主细胞通常是细菌或酵母等单细胞生物。
4. 选择性筛选：使用特定的标记或抗生素等方法筛选出已经成功转化的宿主细胞。
这有助于确保目标基因已经被插入到宿主细胞的基因组中。
5. 复制和表达：将含有目标基因的宿主细胞进行培养和繁殖，以实现大规模的基因复制。
通过适当的培养条件和诱导剂等方法，目标基因可以被表达出来，并产生所需的功能蛋白或产物。
总的来说，基因克隆基于DNA重组技术，利用质粒DNA或其他载体DNA将目标基因导入宿主细胞的基因组中。
这种方法使得科学家能够通过修改和复制基因，研究基因功能、制备蛋白质或生产其他有用的化合物。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告一、实验目的基因克隆是分子生物学研究中的重要技术手段，本次实验旨在通过克隆特定基因，深入理解基因克隆的原理和方法，掌握相关实验操作技能，并获得目的基因的克隆产物。
二、实验原理基因克隆的基本原理是利用限制性内切酶将目的基因从基因组DNA 中切割出来，然后将其连接到合适的载体上，形成重组 DNA 分子。
再将重组 DNA 分子转化到宿主细胞中，通过筛选和鉴定，获得含有目的基因的克隆细胞。
三、实验材料与设备（一）材料1、含目的基因的基因组 DNA 样本。
2、限制性内切酶、DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶缓冲液。
3、载体（如质粒）。
4、感受态细胞（如大肠杆菌）。
5、琼脂糖、琼脂糖凝胶电泳缓冲液。
6、 DNA 分子量标准。
（二）设备1、恒温培养箱。
2、离心机。
3、移液器。
4、电泳仪。
5、紫外透射仪。
四、实验步骤（一）目的基因的获取使用限制性内切酶对含目的基因的基因组 DNA 进行酶切，使其产生与目的基因大小相符的片段。
（二）载体的制备选择合适的载体（如质粒），同样用限制性内切酶进行切割，使其具有与目的基因相匹配的粘性末端。
（三）连接反应将酶切后的目的基因片段与切割后的载体在 T4 DNA 连接酶及缓冲液的作用下进行连接，形成重组 DNA 分子。
（四）转化将重组 DNA 分子加入到感受态细胞中，通过热激等方法促进其进入细胞。
（五）筛选与鉴定1、抗性筛选：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的培养基上，只有含有重组质粒的细胞才能生长。
2、菌落 PCR 鉴定：挑取单菌落进行 PCR 扩增，检测是否含有目的基因。
（六）DNA 提取与电泳检测从鉴定为阳性的菌落中提取质粒 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因的大小和纯度。
五、实验结果（一）抗性筛选结果在含有抗生素的培养基上观察到了部分菌落生长，初步判断这些菌落可能含有重组质粒。
（二）菌落 PCR 鉴定结果对挑取的菌落进行 PCR 扩增后，经琼脂糖凝胶电泳分析，部分菌落出现了与目的基因预期大小相符的条带，表明这些菌落中含有目的基因。
基因克隆本科实验报告
一、实验目的1. 理解基因克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握限制性核酸内切酶、DNA连接酶、质粒载体等工具的使用方法。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析能力。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体DNA中，构建重组DNA分子，并在宿主细胞中扩增。
实验过程中，主要利用限制性核酸内切酶、DNA连接酶等工具进行DNA片段的切割、连接和转化。
三、实验材料与仪器1. 材料：质粒载体、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、DNA琼脂糖凝胶电泳试剂盒、DNA纯化试剂盒、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器、离心机、培养箱、超净工作台等。
四、实验步骤1. 制备DNA模板：以质粒载体为模板，利用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 酶切：将目的基因片段和质粒载体分别用限制性核酸内切酶进行酶切，得到具有相同粘性末端的DNA片段。
3. 连接：将酶切后的目的基因片段和质粒载体在DNA连接酶的作用下连接成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子转化到感受态细胞中，使其成为重组质粒。
5. 鉴定：通过PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法对转化后的细胞进行鉴定，筛选出含有目的基因的克隆。
6. 提取目的基因：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行DNA纯化。
7. 验证：利用DNA测序技术对提取的目的基因进行验证，确保其序列与预期一致。
五、实验结果与分析1. 酶切：酶切后的目的基因片段和质粒载体在DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出两条带，分别对应目的基因片段和质粒载体。
2. 连接：连接产物在DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明目的基因片段和质粒载体已成功连接。
3. 转化：转化后的细胞在PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明转化成功。
4. 提取目的基因：提取的重组质粒在PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明目的基因已成功提取。
5. 验证：DNA测序结果显示，提取的目的基因序列与预期一致，实验成功。
简述基因克隆主要过程
基因克隆主要过程一、基因克隆概述基因克隆是指将一个细胞中的某个基因序列复制并转移到另一个细胞中，从而使目标基因得以表达。
基因克隆的过程包括：选择适当的宿主细胞、构建载体、将目标基因插入载体中、转化宿主细胞、筛选转化成功的细胞并培养、分离纯化目标基因等步骤。
本文将对这些过程进行详细的介绍。
二、选择适当的宿主细胞选择适当的宿主细胞是基因克隆的第一步。
通常情况下，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母等。
选择宿主细胞的标准主要包括以下几个方面：1.易于培养：宿主细胞应具备简单、廉价、高效的培养条件，以便进行大规模的培养和筛选。
2.安全性：宿主细胞不应具备对人体有害的特性，以免对生物安全造成威胁。
3.生长速度：宿主细胞应具备较快的生长速度，以便加快基因克隆的进程。
三、构建载体在基因克隆中，常用的载体有质粒、病毒和人工染色体等。
构建载体的主要目的是将目标基因插入到载体中，并确保其能够被宿主细胞所识别和复制。
构建载体的步骤如下：1.获取载体：从自然界或者实验室中获取合适的载体，并通过酶切和连接等技术进行改造。
2.插入目标基因：将目标基因与载体进行连接，一般通过限制性酶切和连接酶的作用，将目标基因与载体的开放的端部连接。
3.反选：通过选择适当的标记（如抗生素耐药性基因）进行反选，以筛选出成功插入目标基因的载体。
四、将目标基因插入载体中将目标基因插入载体中是基因克隆的核心步骤，常用的方法有PCR扩增插入法、限制性内切酶法和电泳法等。
1. PCR扩增插入法PCR扩增插入法是目前常用的一种方法。
具体步骤如下：1.PCR扩增：使用PCR技术将目标基因的DNA序列扩增得到线性DNA片段。
2.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割成开放的线性片段。
3.连接：将扩增得到的目标基因片段与载体线性片段进行连接，需注意连接时选择合适的限制性内切酶。
2. 限制性内切酶法限制性内切酶法是较为传统的方法，也是基因克隆中常用的一种方法。
具体步骤如下：1.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割为开放的线性片段。
基因克隆
RNA提取两要素
• 忌讳贪多 忌讳贪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上 组织，一般50mg用1mlTrizol较合适 • 速战速决 速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬 Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话， 可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心 10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即 高速离心（14,000rpm,5min），..... 总之尽量快 速！
• 扩增反应条件 • 94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃ • 变性30s,50℃ 30s，72℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸10min。
PCR的基本反应 的基本反应 变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-55˚C
P1 第 一 次 循 环
94℃ ℃
Taq DNApol. P2
E1 E3 E2 X E4 E5 E5 E1
B E4 E3
E2
3、琼脂糖凝胶电泳 （1）原理：电荷效应和分子筛效应 原理： 移动方向： 负极到正极 （2）DNA移动方向： 负极到正极 移动方向 （3）迁移速率：DNA分子的大小和构型 ）迁移速率： 分子的大小和构型 与相对分子量的对数值成反比 相对分子量相同时 超螺旋状DNA 线形DNA 带缺刻的环状DNA 超螺旋状DNA > 线形DNA > 带缺刻的环状DNA
2、限制性内切酶（restriction endonuclease） 、限制性内切酶（ ） 细菌的限制修饰系统 （restriction-modification system） ） （1）类型： ）类型： type I、type III 、 限制性内切活性 切点远离识别位点（移动需要ATP） 切点远离识别位点（移动需要 ） type II 限制性内切活性（ 限制性内切活性（Mg++、Na+、pH、37°C） 、 ° ） 切点与识别位点基本一致
基因克隆实验实验报告
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。
3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。
5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。
基因克隆操作方法有哪些
基因克隆操作方法有哪些
基因克隆是指通过人工手段将一个个体的基因复制到另一个个体中。
下面是常见的基因克隆操作方法：
1. DNA提取：从源个体的细胞中提取DNA，如血液样本或培养细胞。
2. 制备载体：将目标基因插入位于载体DNA中的特定区域，通常使用质粒或病毒作为载体。
3. DNA剪切：使用限制性内切酶切割源DNA和载体DNA，以便在适当的位置形成可互相配对的黏末端。
4. DNA连接：将目标基因与载体DNA连接起来，使用DNA连接酶催化这一反应。
5. 转化：将连接好的重组DNA导入到宿主细胞中，使其重组DNA在宿主细胞内复制和表达。
6. 选择和筛选：使用筛选方法来确定哪些宿主细胞成功地转化了重组DNA，例如通过特定基因的表达产物或对特定抗性标记的抗性。
7. 扩增：将转化成功的细胞进行培养和扩增，以获取足够数量的克隆。
8. 验证：通过PCR、测序等方法验证克隆的正确认。
9. 表达和纯化：对成功克隆的基因进行表达，并纯化所需的表达蛋白。
这些步骤可以根据具体实验目的进行调整和优化，通常需要借助一些特定的实验室设备和试剂来完成。
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Sequence name
Original sequence
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
Sense strand or anti-sense strand
工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要
的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的
遗传性状，包括人体基因治疗。
设计引物（或探针）前要明确的几个方面： 1、明确要做的基因 2、明确做此基因的目的 3、明确检测此基因的技术 4、明确此基因是未知还是已知
如何获得未知基因序列 1、同源序列比对（亲缘要尽可能的相近）， 找到保守序列，设计引物扩增或采用RACE 法扩增 2、对于从未研究的基因，有很多的技术来研 究。
谢谢大家！！
荧光定量PCR引物设计较一般引物设计严格，扩增基因片段 长度大小一般在100-200之间，上下游引物横跨一个内含子， 溶解温度（Tm）为60-65℃之间。
实践是检验真理的唯一标准
对于未知基因，我们得到一些亲缘近的已知 的基因序列进行分析比对得到其保守序列， 依据保守序列来设计引物。 对于已知基因，依据所查序列设计引物即可。
克隆测序：
1、pcr扩增目的基因并回收 2、与克隆载体连接
连接效率非常重要； 目的片段与载体的质量比 3:1-10:1
3、转化涂板培养
感受态非常重要。
4、挑单菌落培养 5、pcr和提质粒酶切筛选鉴定 6、送阳性克隆测序
对测序结果的分析 1、在测序所得序列中找到目的基因序列，采 用NCBI中blast进行比对，或者采用比对软 件进行比对。 2、翻译出氨基酸，进行氨基酸序列比对。
模板的获得：
1、模板类型：DNA或cDNA 2、获得模板的原材料 a 原材料的位置 b 采取原材料的时期 c 原材料的处理和储存 d 提取 DNA或RNA时原材料的用量 3、DNA或RNA的提取 4、反转录获得cDNA时所采用的试剂盒和引物
PCR扩增条件的选择： 1、主要是退火温度的选择 一般选引物Tm值 上下2℃；退火温度越高特异性越强 2、退火时间：时间越短特异性越强 3、延伸时间：根据聚合酶的扩增效率和扩增 基因的大小来确定 4、循环数
克隆基因全长的策略 策略1、从目的基因的第一个碱基和最后一个 碱基开始分别设计引物 策略2、如果策略1不能设计出好的引物或扩 增失败，采用在目的基因两边设计合适引 物，克隆目的基因 策略3、如果前两种方案都不行，采用分段扩 增克隆基因后再拼接触全长
Load sequence
Preimer Premier 启动界面
温度（℃）
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
94
72
60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应 延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃ 退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
克隆基因最根本的是要找到合适的筛选 确定方法
如何获得已知基因序列：
一般在NCBI上查找基因序列，一定要是你 所用样本（或模板）的基因序列，采用引 物设计软件设计引物，pcr扩增
一般引物设计原则 源自
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
引物长度 一般引物长度为18-30碱基。 GC含量 一般引物序列中G+C含量一般为40%-60% 退火温度 一般公式Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 避免扩增模板的二级结构区域 防止与靶DNA或其它样本的错配 引物末端 3‘端不能是A，不能连续4个同一个核苷酸 不要产生引物的二级结构 为了下一步操作而产生的不完全匹配 主观添加的寡核苷酸序列
Useful information of the primer
如果没有找到合适的，只有手动设计，一 般都是在已找到较好的基础上再调整位置 或引物长度。设计好引物后最好在NCBI上 blast一下。
PCR原理和过程
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法。
PCR扩增的两大指标： 1、特异性 2、扩增效率
无论是扩增条件的选择还是各组分的用量都 要兼顾这两个指标。
PCR体系的组成和各组分的影响
1、模板 越少特异性越强 2、DNA聚合酶 不同的聚合酶扩增效率、保真性不同 3、buffer 有不同扩增buffer 4、dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 越少特异性越强 5、Mg2+ 越少特异性越强扩增效率越低 6、primers 越少特异性越强 7、水
克隆植物未知基因的常用技术
1、通过已知基因产物的分析和鉴定 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术 3、以图谱为基础的定位克隆技术
克隆植物未知基因发展中的技术
1、从研究缺失突变体的表型着手分离基因 2、从大的基因组区域直接分离编码序列 3、通过研究mRNA差异表达筛选克隆基因 4、表型克隆法 5、应用DNA芯片技术筛选新基因
基因克隆
基于PCR技术的基因克隆
中心法则
中心法则总结了 生物体内遗传信 息的流动规律， 揭示遗传的分子 基础。
复制
DNA
转录
逆转录
RNA
复制
翻译
蛋白质
基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从 生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获 得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能， 或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因
1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂， 形成单链DNA，称之为变性。 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互 补的一小段DNA片段。 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四 种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺 序合成新的DNA链。