生化技术.

三、 分子生物学技术 重组DNA技术的基本步骤 1.目的基因的获得 2.目的基因与载体的连接 3.重组DNA分子导入受体细胞 4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆 5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离
DNA的提取：组织、细胞、质粒 RNA的提取：组织、细胞 PCR技术：常规PCR、RT-PCR 限制性内切酶 Western blot
—
琼脂糖凝胶电泳

从海藻中提取出来的一种线状高 聚物，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半 乳糖组成三维空间结构。
分离血浆脂蛋白 脂质 CM 98% VLDL 90% LDL 70% HDL 50%
蛋白质 2% 10% 30% 50%
直径 100 75 20 10
CM
LDL
VLDL
HDL
—
+
加样槽
[样品的浓缩] 1、减压加温蒸发浓缩 2、空气流动蒸发浓缩 3、冰冻法 4、吸收法 5、超滤
[干燥] 真空干燥——适用于不耐高温，易于氧化 物质的干燥和保存。 冷冻干燥——在相同压力下，水蒸汽压力 随温度下降而下降，故在低温低压下， 冰很易升华为气体。
[保存]
1、干燥制品的贮存 2、液态贮存 样品不能太稀 一般需加入防腐剂、稳定剂 低温贮存
醋酸纤维素薄膜电泳
血清蛋白质的分离 分子量 白蛋白 66000 α1球蛋白 130000 α2球蛋白 200000 β球蛋白 1300000 γ球蛋白 1500000
pI 4.86 5.02 5.02 5.12 6.8-7.3
加样
β
α1
—
γ α2
+
Βιβλιοθήκη Baidu
白 蛋 白
+
—
清蛋白Alb
γ α1 α2
β
+
β
前β
α
+
—
聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）丙烯酰胺结构式
（2）亚甲双丙烯酰胺
等电聚焦电泳

载体两性电解质
离子交换层析法
4.根据配体特异性的分离法： 亲和层析
5.根据被分离分子的密度 --离心技术
【鉴定】 检测--光谱分析法 RNA & DNA 蛋白质
260nm 280nm
（四）浓缩、干燥、保存
中性盐的选择
硫酸铵 (NH4)2SO4 硫酸钠 Na2SO4
例：分离球蛋白和白蛋白 血清1ml 1ml PBS充分混合。 逐渐加入饱和(NH4)2SO4 溶液至50%，边加边搅拌。
离心
上清
沉淀（球蛋白）
（2）等电点沉淀法（溶解度最小） PI MW Alb 4.86 66 000 α1 5.02 130 000 α2 5.02 200 000 β 5.12 1 300 000 γ 6.8~7.3 1 500 000
四.生化技术的特点： 1.条件温和 2.实验条件与机体内环境尽 量符合
五.生化技术的应用： 1.工业、农业研究、生产
2.生化研究 3.临床应用、诊断
六.发展趋势： 超微量 高效 自动化 快速 综合联用 比色-- 计算机
小结：
1、掌握生物大分子的制备分离纯化的方法； 2、熟悉生化技术的定义和特点； 3、了解生化技术的应用发展趋势。
生化技术 Biochemical Technique
上海第二医科大学检验系 临床生化与生化技术检验
一.什么是生化技术？
生化技术是研究生物体的化学组成 、结构、功能以及在生命活动中化学物
质的代谢、调节控制等的实验方法。
内容： 生物大分子的一般制备 分子生物学的基本操作
分离纯化检测生物大分子
分离 检测
电泳 Electrophoresis 层析 Chromatography 离心 Centrifugation
光谱分析法
二.生物大分子的一般制备法
体液： 直接分离生物样品
组织细胞：先破细胞分离 检测
生物大分子制备的四个阶段
选择材料和预处理 组织细胞的破碎及细胞器的分离 生物大分子的分离纯化 浓缩、干燥和保存
当溶液中盐浓度不断上升，达到 一定程度，蛋白质等的溶解度反而 逐渐减小，并先后从溶液中析出， 称为“盐析”。
盐析作用的产生 由于盐离子同水分子发生水合作用， 造成盐离子与蛋白质分子争夺水分子， 减弱了蛋白质的水合程度。 蛋白质表面的电荷被盐溶液中对应的 离子中和，其水化膜层被破坏，使蛋 白质等的溶解度下降，蛋白分子相互 聚集而沉淀析出。
（三）生物大分子的分离、纯化 以蛋白质为例
【提取】相似相溶 1.水溶液的提取 中性盐溶液提取： 缓冲液提取： 2.有机溶剂提取
【分离纯化】 1.根据蛋白质溶解度不同的分离方法： （1）盐溶与盐析 （Salting in & Salting out) 蛋白质、酶及其它们与其它物质 的复合体在离子强度低的盐溶液中， 其溶解度随着盐溶液浓度的升高而增 加，此现象称为“盐溶”。
（一）材料选择和预处理： 微生物 植物 动物
（二）组织细胞破碎的方法：
1.物理方法： 玻璃匀浆器(homogenizer)
研钵（加净砂或玻璃粉）
高速组织捣碎器
超声波
渗透压法 反复冻融法
2.化学方法
有机溶剂（破坏细胞膜的脂质 双分子层）
3.酶法
自溶法（蛋白酶、酯酶） 酶解法（溶菌酶破坏细胞壁的 -1，4-糖苷键）
超滤（反向渗透） 利用压力或离心力，迫使水和其他小的 溶质分子通过半透膜，而蛋白质不能透过半 透膜仍留在膜上。
（2）凝胶层析法（Gel Chromatography) 利用各种物质分子大小不同，在固定 相上受到阻滞程度不同而达到分离的一种 层析方法。
（3）SDS-PAGE
3.根据蛋白质带电性质差异的分离方法： 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 离子交换层析法
思考题：
1、常用组织细胞破碎的方法有哪些？ 2、请列举生物大分子分离纯化的方法，并 分别简述其原理。
参考书目：
赵永芳主编《生物化学技术原理及其应用》 第二版；第三版
（3）低温有机溶剂沉淀法
△甲醇、乙醇、丙酮使多数蛋白质溶解度降低 并析出。 △脱水、介电常数小 △分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在 低温下进行。
（4）聚乙二醇沉淀法
2.根据蛋白质分子大小不同的 分离方法：
（1）透析和超滤 （Dialysis & Ultrafiltration) 透析： 利用溶液组分能否通过半透膜并由引起 膜两边溶液的化学势能不同，而达到去除溶 液中的小分子物质。