实验六、吲哚乙酸氧化酶活性的测定(精)

生长素 赤霉素
细胞分裂素 主要是根尖
脱落酸
乙 烯
根冠、萎蔫的叶片等
植物体各个部位。
•生长素是什么
1934年提取： 吲哚乙酸（IAA）
具有生长素效应的还有：
苯乙酸（PAA）
吲哚丁酸（IBA）
•
生长素的发现
Darwin的向光性实验
燕麦胚芽鞘
燕麦胚芽鞘去除顶端
Darwin的向光性实验
燕麦胚芽鞘 加不透明帽子
自由生长素
有活性
•生长素的降解：
1）光氧化；
脱羧降解
（吲哚乙酸氧化酶IAA oxidase）
2）酶促降解
不脱羧降解
2、综上所述
• 吲哚乙酸氧化酶能调节植物体内IAA的水平， 从而影响植物的生长。 • 生长素分布在生长旺盛的部位，IAA氧化酶 分布在生长不旺盛的部位。
• 酶活力的大小可以用破坏IAA的速率表示， 即： IAA氧化酶活力 = IAA减少的速率
同时，配制IAA梯度浓度溶液各10mL
试管 IAA 梯度液 0 1 2 3 4 5 6
0
ug/ml
2
5
10
ug/mL
15
ug/mL
20
ug/mL
25
ug/mL
ug/mL ug/mL
另取7支试管，每支加入试剂B 2mL，再按表加 入IAA的梯度浓度溶液各1mL 。 •以0管溶液调零，分别测定530nm处吸光值。
茎：背向茎尖运输 根：背向根尖运输
•生长素的生理作用和最适浓度
促 进 生 长 抑 制 生 长
根
芽
茎
低促 高抑
0
A
10-10
10-8
10-6
10-4
10-2
c/mol· L-1
对生长素的敏感度：
•生长素浓度的调节方式：
合成、降解、运输、结合、区域化
生长素的结合： 束缚生长素
无活性 与糖、氨基酸等结合
F.W.Went的实验
燕麦胚芽鞘 去除顶端，加琼脂块
燕麦胚芽鞘 去除顶端，加处理过的琼脂块
实验结论总结
胚芽鞘的感光部位： 胚芽鞘的尖端 生长素的产生部位： 胚芽鞘的尖端 生长素的作用部位 胚芽鞘的尖端下段 （胚芽鞘的生长部位）
结论：
• 胚芽鞘顶端能产生化学物质，向下传输到 去顶胚芽鞘，并影响后者的生长； • Went称这种化学物质为生长素 ； • 1934年首次提取纯化出刺激生长的物质， 经鉴定为吲哚乙酸（IAA）。
• 30min后另取2支试管，每支加入试剂B 4mL，再按 表加入反应液orIAA的梯度浓度溶液各2mL 。
试管 实验’ 对照’
反应液 （各）
实验溶液 2mL
对照溶液 2பைடு நூலகம்L
•
2支试管于40 ℃下保温30min，使反应液呈红色。
• 530nm处测OD值，分别记为OD实验、OD对照。
4.制作标准曲线
生长素为什么能引起向光弯曲？
单侧光使背光一侧比向 光一侧生长素分布得多； 背光一侧的细胞纵向生 长的快，结果使得茎朝 向生长慢的一侧弯曲。
•生长素的分布与运输
生长素的产生部位 生长素的分布 生长素的运输方向 主要在幼嫩的芽、叶、 发育的种子。 大多集中在生长旺 盛的部位。 从植物体形态学上端 向形态学下端运输 。
四、思考题
• 步骤（一）中为何取材时去除子叶与胚根， 留取胚轴？ • 反应混和液为何中加入氯化锰和2、4-二氯 酚？
• IAA氧化酶在植物的生长发育过程中一般起 着什么作用？为何在生产实践中一般不用 IAA，而用NAA或2、4-D等生长调节剂？
2、一些具有植物激素活性的人工合成物质。
•五大类激素的生理功能
种 类 生长素
主要生理作用
促进生长、 促进生根、发芽 促进细胞伸长、促进种子萌发、 果实成熟 促进细胞分裂
赤霉素
细胞分裂素 脱落酸
抑制细胞分裂、促进叶、果实衰 老脱落 促进果实的成熟
乙
烯
•五大类激素的产生部位
种
类
主要合成部位
主要在幼嫩的芽、叶、发育的种子 未成熟的种子、幼根、幼芽
5、结果计算
• 以0~6管的IAA浓度为横坐标，以相应的OD值为 纵坐标，绘制标准曲线。 • 根据实验、对照管的OD值，在标准曲线上查出 相应的IAA浓度。 • IAA氧化酶活性 （ugIAA/g FW.h)
(C对照-C实验)*VT*V = W.t.V1
VT：酶液总体积； V：步骤2所得反应液体积； V1：反应所用酶液体积
燕麦胚芽鞘 加透明帽子
达尔文的推测：
单侧光照射使胚芽鞘的尖端产生某 种刺激，当这种刺激传递到下部的伸长 区时，会造成背光面比向光面生长快， 因而出现向光性弯曲。
詹森的实验（1910）和拜尔的实验（1914）
詹森实验证明： 胚芽鞘尖端产生的刺激 物可以透过琼脂片。
拜尔实验证明： 弯曲生长是因为顶尖产 生的刺激物分布不均匀 造成的。
• 1mmol/L的氯化锰；
• 200ug/mL 的吲哚乙酸（少量乙醇溶解后定容）；
• 试剂B：0.5mol/LFeCl3-35%过氯酸(V:V=1:50)， (使用前混合，避光保存）。
三、实验原理
1、知识背景
知识背景：植物的生长物质
• 定义：调节植物生长发育的物质。 • 分类：
1、植物激素（plant hormone） 在植物体内合成、并从产生处运送到别 处，对发育产生显著作用的微量有机物；
实验六、吲哚乙酸氧化酶活性 的测定
南京师范大学 生命科学学院
一，实验目的与要求
• 了解吲哚乙酸氧化酶的生理功能和 分布； • 掌握测定植物体吲哚乙酸氧化酶活 性的方法。
二，实验材料与试剂
1，材料
绿豆幼苗的下胚轴。 2，试剂
• 20mmol/L的磷酸缓冲液（pH6.0)； • 1mmol/L的2、4-二氯酚；
3、实验设计
在无机酸存在下，IAA能与FeCl3作用， 生成红色的螯合物。该物质在530nm处有最 大光吸收峰。
注意：如果待测物与另一底物反应后 1，生成稳定的产物； 2，产物有特定的光吸收峰。
比色法 （分光光度法）
三，实验步骤
1，提取IAA氧化酶 称取0.5g绿豆下胚轴，分次加入预冷 的磷酸缓冲液（pH6.0）5mL，冰浴研磨， 4000rpm离心20分钟，取上清液，即为粗 酶液。
2，IAA氧化酶与IAA的反应
试管号 MnCl2 2、4二氯酚 IAA (200ug/mL) 酶液 磷酸缓冲液 (pH6.0)
实验
1mL
1mL
2 mL
1 mL
5mL
对照
1mL
1mL
2 mL
——
6mL
两管分别混匀，25 ℃水浴保温30min。
3，测定IAA氧化酶活性
• 混合试剂B： 0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸(V:V=1:50)