实验8 吲哚乙酸氧化酶活性的测定

实验八吲哚乙酸氧化酶活性的测定

一、实验目的

熟悉用比色法测定吲哚乙酸氧化酶活性的方法；

掌握标准曲线的操作及绘制方法；

掌握酶活力测定的基本要求。

二、实验原理

吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。

三、实验材料

绿豆下胚轴和胚根

四、仪器药品

721型分光光度计、离心机、恒温水浴锅、天平、研钵、试管、移液管、烧杯

磷酸缓冲液pH6.0，2，4—二氯酚；氯化锰溶液；吲哚乙酸；显色剂

五、操作步骤

1．取0.5g绿豆下胚轴（胚根），置研钵中，加入磷酸缓冲液5ml，石英砂少许，研磨成匀浆。离心（4000r/min）20分钟，所得上清液即为粗酶液。

2．取试管2支，于一试管中加入氯化锰1ml，二氯酚1ml，IAA2ml，酶液1ml，磷酸缓冲液5ml，混合均匀。另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。一起置于30℃恒温水浴中，保温30分钟。

3．吸取反应混合液1ml，加入显色剂4ml，摇匀，置于40℃的黑暗处保温15分钟，使显色。

4．将显色后呈现红色的反应液于分光光度计中测定吸光度，测定时用波长530nm。

5．根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量（或从直线方程式计算反应液中IAA的残留量）。

6．从开始时加入的吲哚乙酸量减去酶作用后残留的吲哚乙酸量，即得被酶所分解破坏的吲哚乙酸量。以每ml酶液在1小时内分解破坏吲哚乙酸量(μg)表示酶活力的大小。

7．配制浓度从0~25μg/ml的IAA溶液，分别测得吸光度A，然后绘制标准曲线，或计算直线回归方程。

六、思考题

1. 反应混和液为何中加入氯化锰和2、4-二氯酚？

2. IAA氧化酶在植物的生长发育过程中一般起着什么作用？为何在生产实践中一般不用IAA，而用NAA或2、4-D等生长调节剂？