第九章 柠檬酸发酵

己糖、淀粉等原料柠檬酸 EMP糖酵解途径
丙酮酸羧化 通过三羧酸循环形成柠檬酸
柠檬酸发酵需要下述环境条件：(1)磷酸盐浓度低；(2)氮源 用NH4+盐；(3)pH值低（<2.0）；(4)溶氧量高；(5)Mn2+、 Fe2+、Zn2+含量极低。
柠檬酸积累到一定水平，它就能抑制自身的进一步分解，从 而促进自身的积累。
氨基酸 合成 蛋白质 分解 氨基酸
氨基化合成氨基酸
• 顺乌头酸酶活性的控制
• 该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条
件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发 酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+ 的影 响，控制培养基中的Fe2+ 的浓度，可以使该酶失活。因此，柠 檬酸发酵要求采用不锈钢为反应器的材料，目的就是控制培养基 中的Fe2+ 的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+ 的浓度有要求不能够低于0.1mg/L
第九章 柠檬酸发酵 柠檬酸（citric acid）,枸橼酸 学名：2-羟基-丙烷三羧酸或 -羟基丙三酸 分子式C6H8O7 ，分子量192.13 无水柠檬酸是无色半透明全对称晶体 柠檬酸在化工、医药、食品等方面有广泛的用途
一. 柠檬酸生产菌 青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉等 利用淀粉质原料大量积累柠檬酸 国内利用黑曲酶（Aspergillus niger） 工艺: 固体或液体深层发酵 原料: 甘蔗渣、废糖蜜、白薯、马铃薯、 玉米等
TCA循环与柠檬酸的形成
黑曲霉的柠檬酸合成途径
• 葡萄糖 CoA)
• • CO2固定反应 • CO2固定反应 •
• • • • • • • • • •
柠檬酸的生物合成途径
丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰辅酶A(CH3CO-
草酰乙酸 + • （柠檬酸合成酶）
异柠檬酸
柠檬酸 顺乌头酸酶 异柠檬酸脱氢酶
α —KGA 琥珀酸
二. 柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵菌种为黑曲霉。在正常情况下，柠檬酸不会在细胞 内大量积累，而且柠檬酸还是黑曲霉的良好碳源。在积累柠檬酸 的情况下，TCA循环已被阻断，必须要有另外的途径提供草酰乙 酸。黑曲霉中存在两种CO2固定系统，其中丙酮酸羧化酶是结构 酶。 PEP+CO2+ADP草酰乙酸+ATP PYR+CO2+ATP+生物素草酰乙酸+ADP+Pi
• 按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能 够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，被彻底氧化，柠 檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌 种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的
各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶 的
活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降 解成其他物质。
化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的
呼吸链称之为标准呼吸链。后来的大量的实验证明，在某些微生
物体内确实存在一条这样的侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系 强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很 低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分
钟）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，
柠檬酸积累机理概括：由于锰缺乏抑制了蛋白质合成而导致 细胞内NH4+浓度升高和一条呼吸活性强的侧系呼吸链不产 生ATP，这两方面的因素分别解除了对磷酸果糖激酶的代 谢调节，促进了EMP途径畅通。由组成型的丙酮酸羧化酶 源源不断提供草酰乙酸。在控制Fe2+含量的情况下，乌头 酸水合酶活性低而不能及时转化柠檬酸。一旦柠檬酸浓度 升高，就会抑制已柠檬酸脱氢酶，从而进一步促进了柠檬 酸自身的积累
• 柠檬酸的发酵条件：碳源--黑曲霉能很好地利用淀粉、 麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖等。黑曲霉虽 然有糖化能力，但其糖化或液化能力不强。为了缩短 发酵时间，淀粉原料总是要经过糖化或液化处理；氮 源--黑曲霉偏好于无机氮源，当有机和无机氮源同时 存在时，无机氮源首先被利用。NH4+被利用后，培养 基pH下降，有利于柠檬酸的积累。pH值--黑曲霉的生 长和柠檬酸的积累需要不同的酸度条件。黑曲霉生长 时的pH范围可控制在3-7，产酸时控制在3以下。温度-黑曲霉的最适生长温度为33-37oC；积累柠檬酸的最 适温度为32oC。
抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或
阻遏是如何被克服的呢？
• 1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节
•
从葡萄糖到柠檬酸的合成过程中，磷酸果糖激酶
（PFK）是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受
到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠
檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，
停止柠檬酸的合成
酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止
• 如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型）， 则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍 然不能够合成柠檬酸。而实际上，确实柠檬酸产生菌可以在有氧
的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有 产生ATP。
• 为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条ຫໍສະໝຸດ Baidu 系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧
而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代 谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，
在生产上通常称之为：只长菌不产酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，
却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要 自己备用的发电系统）。
三. 柠檬酸发酵的工艺
4. 深层发酵工艺条件
• 菌体有了上述特点，只是具备了合成并积累一定量的 柠檬酸的条件，要想大量的合成柠檬酸，或者说，追 求柠檬酸的高产率，还需要解决柠檬酸合成过程中的 代谢调节与控制的问题。
柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制
•
柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产
物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累
的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到
1）温度：28~30°C 初期温度稍高，有利于菌体繁殖 产酸期后温度稍低，有利于产酸
2）pH:低 pH 条件下产生柠檬酸,中性 pH 条件下形成 草酸 3）通气和搅拌
黑曲霉是好氧菌，提高发酵罐内溶氧水平 可提高柠檬酸产量 4）培养基的液化 加少量-淀粉酶促进液化 5）接种方式：二级种子，麸曲孢子 6）原料中糖的浓度
• 3.能荷调节对柠檬酸发酵的影响
•
菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代
谢途径需要畅通，在这个过程中，有一步反应：丙酮酸氧化脱羧，
每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的
NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，
造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的
• Mn+ 缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？
•
当培养基中Mn+ 缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累
几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意
味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到
影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高，微生物体内蛋 白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：
5. 柠檬酸的提取 1）柠檬酸结晶:发酵液用蒸馏水搅匀,加热到100C处理后10层 纱布过滤,向清液中加入碳酸钙进行中和,使柠檬酸形成柠檬酸钙 而沉淀析出 2）酸解:柠檬酸钙加水搅成糊状,用硫酸缓慢酸解,加入足够量的硫 酸,使柠檬酸游离出来 3）脱色和去除各种阳离子:活性炭脱色, 阳离子树脂去除各种阳离 子,流出液pH为4时，开始收集 4）浓缩结晶:减压浓缩,冷却并缓慢搅拌,使结晶颗粒均匀
• 微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈 抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形 成柠檬酸，那么NH4+ 浓度是如何升高的呢？
• 研究表明，柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn+ 缺乏的培养
基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺 乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性 的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。