细菌内毒素的简介共40页

品、国家标准品和工作标准品。
在我国，细菌内毒素国家标准品系自大肠杆 菌提取精制得到的内毒素。
2019年WHO 建立第二批国际内毒素标准 品（94/580，10000IU），规定1IU=IEU。 981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标 准品，共生产8批。
细菌内毒素工作品分为冻干品和液体两种 剂型，均可用于鲎试剂复核、干扰试验和 实验中的阳性对照。本品为一次性使用。
4.9.增加了凝胶半定量试验，通过确定反应终 点浓度来量化供试品中内毒素的含量。
4.10.较详细讲述了光度测定法的方法。
二、标准部分
2.1 细菌内毒素检查法 （中国药典2019年版） 2.2 医用输液、输血、注射器细菌内毒素检
查法GB/T14233.2-93 2.3生物材料和医疗器材的细菌内毒素检查法 （卫生部药政局2019年药发[2019]第81号 ）
2.9细菌内毒素检查用水 2019年版中国药典规定细菌内毒素检查用 水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度 的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用 水。
3 细菌内毒素的化学结构、量值和限值 3.1化学结构
细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要 有两部分组成：多糖和类脂A。多糖部分又 可进一步分为O-特异性多糖链、核心寡聚 糖。O-特异性脂多糖一般由3-6个单糖通过 糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是 LPS分子中最易变异的成分。
2支供试品。
结果判断
PC为阳性 PC为阳性 PC为阳性
NC为阴性 PPC为阳性 PPC为阳性
样品均为阴性，NC为阴性 NC为阴性
合格
样品均为阴性，样品均为阴性，
合格
合格
其他
鲎试剂灵敏度 无热原注射用 细菌内毒素检
0.25EU/ml 水0.05EU/ml 查用水内毒素
供试品细菌内 为浸提介质 含量小于
3.2细菌内毒素的量值
2019年WHO建立第二批国际内毒素标准 品(94/580，10000IU),规定1IU=1EU。
我国国家标准品981是用IS2为基准标定的 我国第6批国家标准品。每支含内毒素 9000EU。
3.3 细菌内毒素的限值
供试品细菌内毒素限值按一下公式确定 L=K/M，式中L为供试品内毒素限值，以 EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按给药途 径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量， 以EU/kg表示，注射剂K=5EU/kg/hr。M为 人用最大剂量，以 ml/kg/hr,mg/kg/hr,U/kg/hr表示，中国人均
1.2干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素 检查方法以及供试品阳性对照结果呈阴性 时确定供试品是否存在抑制作用。
1.3 供试品检查时，阴性对照、阳性对照、 和供试品阳性对照必须同时进行，否则结 果无效。
2试验材料及用具
天平、电热干燥箱（180~300℃ ）、恒温 水浴箱（37± 1 ℃）、漩涡混合器、鲎试 剂(应具有国家主管部门的批准文号）、细 菌内毒素工作品、细菌内毒素检查用水； 其他试验用具如移液枪、封口膜、一次性 安剖等。
1980年USP20版；1987年欧洲药典、1989年英国药 典1989增补本、1988年日本药典第11增补本、1993年中 国药典1990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。
1.2 细菌内毒素在我国的发展
在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始 将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究， 1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。 1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4种 药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试 方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始 收载细菌内毒素检查法。2019年版中国药典规定 13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典 规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2019年版 药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。
核心寡聚糖分为内核和外核。外核 由数种己糖组成，内核含有庚糖特 殊的酮糖，这部分结构对不同菌株 的LPS基本相似。类脂A是LPS的 毒性及生物活性中心。典型的类脂 A含有一个以β1’，6-糖苷键相连的 D-氨基葡萄糖双糖组成的基本骨架， 双糖骨架的游离羟基及氨基可携带 长链脂肪酸和磷酸基团。不同种属 细菌合成的类脂A的分子组成及其 骨架上的取代基团性质有差异。
1.1细菌内毒素检查法
1885年美国的W.H.Howell发表了一篇有关鲎血的化学 组成和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史的开 端。1956年，美国动物学家F.Bang发表论文《鲎的一种 细菌性疾病》，阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。19 64年F.Bang和J.Levin提出了鲎血凝集的初步机理，1968 年正式建立鲎试验（Limulus test,LT)方法。
2.7细菌外毒素与细菌内毒素
细菌外毒素是一种由活菌合成并释放出来， 对热敏感的蛋白质。
细菌内毒素是一种对热抵抗，且只有当 菌体死亡裂解或人工破碎后方可释放来。
外毒素与内毒素的主要区别
区别要点 来源 存在不位
外毒素 G+、部分G胞浆内合成分泌至菌体外
内毒素 G细胞壁成分
化学成分 蛋白质
脂多糖
稳定性
4中国药典2019年版细菌内毒素检查法的修订内容
中国药典2019年版较中国药典 2000年版有重大修订，主要修订 内容如下：
4.1.定义改变：2019年版药典定义 细菌内毒素检查法为利用鲎试剂来 检测或量化由革兰氏阴性菌产生的 细菌内毒素，以判断供试品中细菌 内毒素的限量是否符合规定。
4中国药典2019年版细菌内毒素检查法 的修订内容
细菌内毒素检查法在药品和医 疗器械检查中的应用
细菌内毒素检查
本讲座共分三部分 一、基础部分 二、标准部分 三、实验操作部分
一、基础部分
1. 前言
防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重 要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安 全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展，该方法已不 完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替 代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应 用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器 械质量控制中的一项重要指标。
毒素限量不超
0.015EU/ml
过0.5EU/ml
样品溶液不稀
释，当结果出
现阳性时， 1→2稀释，4 支，1支阳，
三、试验操作
1.简述
1.1 鲎试剂灵敏度复核项的目的不仅是考察 鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的 效价是否准确，也是考察检验人员操作方 法是否正确和试验条件是否符合规定。因 此每个实验室再将一批新的鲎试剂用于试 验前应进行鲎试剂灵敏度复核项试验。
Σ x2 Σ x2 4
3
当s＜0.365时按 λ=log-1(Σx/4)
计算鲎试剂的灵 敏度；s≥0.365 时，测定无效。
检测2.0λ、λ 检测2.0λ、λ、
0.5λ、0.25λ 0.5λ、0.25λ的
的组阴度性的S 标内，性的，4管准毒同，最4管均差素时最低均为平做高浓为阴行浓度4管阳性4。内组管浓管最0为.2毒，阴度均低阴5λ素同性为浓性2的.0平时，阳度λ4的行做最性管4大，42均
2个以上厂家的鲎试剂
检 供试品至少3个 样品稀释到MVD， 样品稀释到MVD，
查 浸提介质：内毒素 1支NC, 1支PC,1支 2支NC, 2支PC,2支PPC
法 含量＜0.05EU/ml PPC
2支供试品。
输液器10ml,输血 2支供试品。
器15ml,反复荡洗
5次后两端密闭， 37 ℃2h后合并
2支NC, 2支PC,
2.5鲎– 鲎是一种栖生于海洋的低等无脊椎动物，出现在古代 泥盆纪，现存于世的有三属四种，常见的有两种，美洲鲎和 东方鲎
2.6细菌内毒素—是革兰氏阴性菌的细胞外 壁层上的特有结构，即脂多糖，具有广泛 的生物活性，以致热居首。其量值以国际 单位（IU)或内毒素单位（EU)表示，现规 定1 IU=1 EU。
X 4个连续内毒 素稀释液最低
NC均为阴性
阳性结果浓度 λc=lg-1(Σx/4)
的对数值。 λ在
0.5λ~2.0λ间
有效
干
扰 试
未涉及
验
比较鲎试剂在水中 比较鲎试剂在水中和样 和样品中的灵敏度， 品中的灵敏度，各平行 各平行4组，结果Es、 4组，结果Es、Et均应 Et均应0.5λ~2.0λ之 0.5λ~2.0λ之间，样品的 间，样品的稀释不 稀释不大于MVD,3个批 大于MVD,3个批号 号
3.凝胶实验技术 3.1凝胶法的实验程序
1试验准备：试剂、仪器及用具等 2 确定药品的细菌内毒素限值L 3选择鲎试剂的灵敏度λ 4 计算供试品的最大有效稀释倍数或最小有 效浓度
5 鲎试剂灵敏度复核 6 药品与鲎试剂相容性的初筛试验 7 供试品干扰试验 8 干扰试验的验证 9 供试品日常的内毒素限量检查
2.3细菌内毒素检查法—2019年版中国药典定义为：系利用 鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以 判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。
2.4鲎试剂—我国生产的鲎试剂系鲎科动物东方鲎的血液变 形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，用于细菌内毒素检查。 根据检查方法分为凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂；根据鲎试 剂与内毒素反应的专一程度分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。 特异性鲎试剂是专一对内毒素反应的鲎试剂。鲎试剂灵敏度 用符号λ表示，单位用EU/ml表示。
30min,塑料器具 至少2h,也可 也可用其他
30%双氧水4h， 用其他适宜的 适宜的方法，
无热原水冲洗后 方法。
并应确证不
60 ℃烘干。
干扰BET的检
查
鲎试剂灵 敏度复核
检测能出现阳性 结果阴性结果的 4个连续2倍等比 稀释液，平行4 管，37±1℃保 温60±2min,最 高浓度的4管均 为阳性，最低浓 度的4管均为阴 性。按公式计算