农杆菌侵染拟南芥方法
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。
28°C、220rpm过夜培养。
农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。
2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。
3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。
OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。
倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。
浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。
正常光照培养。
每隔七天转化一次。
可转化3次
提高转化效率。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
拟南芥蘸花法
农杆菌蘸花转化拟南芥法1、将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h；2、然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0范围内；3、离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀；4、将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉);5、然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次；6、收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。
拟南芥播种1、将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;2、在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。
3、幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养土=1：3）。
植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
注：几种常用抗生素的工作液浓度Kanamycin 50μg/mlGentamicin 50μg/mlRifampicin 25-50μg/mlHygromycin 50μg/mlBarstar 25-50μg/ml注：MS培养基配方（1L）MS盐 4.4gMES 0.5g蔗糖10g调PH至5.8-6.0加Agar 10g(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.AnalBiochem166:368–379.。
农杆菌转化拟南芥
农杆菌转化拟南芥1．农杆菌感受态制备①从YEB平板培养基上挑取农杆菌单克隆，接种于5 mL YEB （含50µg/mL 利福平）液体培养基中，28ºC，200 rpm，过夜培养；②取2 mL过夜培养液接种于50 mL上述含有利福平的YEB液体培养基中，28ºC，200 rpm，摇床培养至OD达到0.5；③菌液冰浴30 min，转至预冷的50 mL离心管中，4ºC，5000 rpm，离心10 min，收集菌体；④ 2 mL预冷的50 mM 无菌CaCl2溶液（含15%甘油）悬浮菌体，即为感受态细胞；以100 µl/管分装，液氮速冻后，保存于-70ºC冰箱，备用。
2．质粒转化农杆菌感受态①吸取构建好的表达载体质粒5 µl，加入到100 µl感受态细胞中，混匀；②冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37ºC热击5 min；③加入800 µl YEB液体培养基，28ºC，200 rpm，摇床培养5 h；④离心，留200 µl上清重悬沉淀，将菌液涂于YEB固体培养基（含质粒对应的抗生素），28ºC培养2 d，挑取单克隆，检测筛选阳性克隆，摇菌后-70ºC保存，用于下一步植物转化。
3．农杆菌侵染拟南芥花序①将筛选的阳性农杆菌在YEB（抗生素）固体培养基划板培养，至长出单克隆后挑3-5个单克隆，于5 mL YEB（抗生素）液体培养基中，28ºC，200 rpm培养16 h，（以培养基变得很浑浊为准），保菌之后全部接到250-500 mL的培养基中，培养16 h以上；②5000 rpm离心20分钟，然后用转化液（1/2MS（只用大量和微量元素），添加50 g/L的蔗糖，调pH为5.8左右，然后加200 ul/L的Silwet L-77混合），剧烈悬浮沉淀至完全悬起；③在拟南芥盛花期，将悬浮液直接浸泡地上部分约1分钟，然后用保鲜膜完全包裹以保湿，放回培养室12小时以上打开保鲜膜；④待种子成熟后（半个月左右），收取种子用于下一步筛选工作。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
05
CATALOGUE
实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
02
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学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
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等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
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04
将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
农杆菌侵染拟南芥
拟南芥侵染方法：
1、取150ml 含相应抗生素的液体LB培养基，接入2-3ml准备好的农杆菌菌液，大摇过夜
至培养基由红色转为黄色。
2、将培养后的150ul农杆菌菌液导入灭过菌的50ml离心管中，4℃，3000rmp离心15min
3、弃上清，加入50ml 1／2 MS，将菌泥搅起
4、将培养4周左右,刚开花的拟南芥植株上的果荚去除，将上面准备好的菌液倒入培养皿
中，将整个花序浸入菌液10sec
5、将浸好的拟南芥植株在黑暗条件下，处理18-24h后继续光照，一周后可再dip一次
用于Dip的1／2 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 1／2 MS液）
MS大量5 ml
蔗糖10 g
水95 ml
表面活性剂20 ul
常用1／2 MS配方（1 L）：
10X大量元素50 ml
100X微量元素 5 ml
100X铁盐 5 ml
蔗糖（1%）10 g
琼脂粉8 g
拟南芥生长土壤：
腐殖土：蛭石=1:1混匀，装双层袋子，高压121℃灭菌40分钟
注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。
种子消毒：
30%H2O2+85%乙醇1:4混合
取250微升混合液加入种子种用枪头吹打40S，放在滤纸上晾干，然后铺在1／2 MS平板上。
4℃冰箱中放置春花1-5天，一般新种子春花时间长点。
16\8 光周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。
营养土产家：吉林省德惠市芳洁花土厂(花卉营养土) 我们是从北京际翔园艺花圃公司买的。
[必读]农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
![[必读]农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法](https://img.taocdn.com/s3/m/fc83f73f657d27284b73f242336c1eb91a37334e.png)
0000000000农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法00000000制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥
采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥刘慧娟;冯志国;李先文;李涛;何光源【摘要】利用农杆菌花序浸染法将构建的植物表达载体pBI121-tp-crtB转入拟南芥(Arab idopsis thaliana)野生型Columbia中,共获得了14株转基因系,并进行了转基因拟南芥种子萌发实验.结果表明tp-crtB基因已经成功转入拟南芥中,其不影响拟南芥种子的正常萌发.%The plant expression vector pBI121-tp-crtB was transformed into wild Arabidopsis thaliana(Columbia) via Agrobacterium tumefaciens-floral dip method.Fourteen transgenic plants were obtained.Seed germination experiment was conducted;and the result showed that tp-crtB gene was successfully transformed into A.thaliana and had no obvious effect on the seed germination of A.thaliana.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2013(052)001【总页数】3页(P200-202)【关键词】crtB基因;农杆菌花序浸染法;拟南芥(Arabidopsis thaliana)【作者】刘慧娟;冯志国;李先文;李涛;何光源【作者单位】信阳师范学院生命科学学院,河南信阳464000;华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室,武汉430074;信阳师范学院生命科学学院,河南信阳464000;华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室,武汉430074;信阳师范学院生命科学学院,河南信阳464000;华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室,武汉430074;重庆警察学院,重庆401331;华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q943.2类胡萝卜素（Carotenoids）是一种在自然界中分布广泛、种类丰富的色素，导致许多植物的果实、花及块根呈现橙红色、黄色或红色。
实验1拟南芥室内培养观察与农杆菌转化拟南芥
叶盘法 原生质体共培养 创伤植物感染法
原生质体培 养
农杆菌介导存
农杆菌介导拟南芥的转化
实验原理
技术应用
一种方便，高效的植物转基因方法，多用于转化双子叶植物， 经过改进后也逐渐用于单子叶植物的转化。
McKinney et al 2001
拟南芥转基因技术：
发育生物学实验
2016年
实验1 拟南芥室内培养观察及 农杆菌转化拟南芥
一、拟南芥简介
二、实验技术---农杆菌介导拟南芥转化
农杆菌介导拟南芥的转化
实验目的
1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理 2、掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法 3、了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
实验材料
拟南芥转基因技术： McKinney et al 2001
1、影响因素 MS salts, hormone, OD of bacteria etc.
2、 3、 4、
作业
预习：烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生
课后各组查阅资料，设计3个不同浓度的NAA和 6-BA，用于诱导不同器官，如芽、根、叶等
8、高压灭菌
（1） MS培养基（121ºC,15分钟）。 （2）玻璃烧杯：200ml 2个、500ml 1个、 50ml的三角瓶
20个、培养皿8个（ 4培养皿装滤纸，6片/平皿）。 （3）枪型镊子、剪刀各2把。 （4）1ml、200ul、20ul的tip头各1盒。 (5)无菌水500～700mL*2
农杆菌GV3101重组菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300 ， 拟南芥
实验试剂
LB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； 转化介质 ：MS培养基、5%蔗糖，0.03%SilwetL-77，KOH调 pH 5.7。
花序侵染法侵染拟南芥
花序侵染法
1.植物培养
a)打顶，从底部剪去第一个花序，
b)约一周后（视培养条件），侵染前一天浇水
c)最适宜浸染时间：主花序结荚，次花序约2-10cm长，有少量花开。
2.农杆菌侵染
培养基：YEP+抗生素
培养条件：28~30度，250 rpm（10g 蛋白胨，5g 酵母提取物，5g氯化钠）
a)单克隆，过夜，约10ml
b)1:100 接种到200 ml扩培约18-24小时，使得0D600=1.8-2.0（很重要！
OD代表了生长状态）；
c)配制新鲜侵染液1/2 MS（无需灭菌，但要新鲜），5.0%蔗糖；0.05% Silwet
L-77,Ph=5.7，（ph等并不重要，但是，蔗糖和Silwet一定要加）
d)5500g，20 min收集菌体，用侵染液重悬，使得OD600=0.8（大约即可，）
e)侵染，将植物上部分组织浸入侵染液3-5秒，并轻轻晃动
f)套筒，保持湿度和避光，过夜（侵染时无需避光，侵染后需要避光，保
持湿度很重要）
g)第二日移入正常生长培养箱中，直到收种
3.筛选
a)种子消毒
i.75%乙醇，2-3分钟，去离子水冲洗
ii.次氯酸钠，10分钟，去离子冲洗三次
b)播种
i.播种于含抗性的1/2MS(Sigma#M-5519);0.8% agar培养基上。
农杆菌转化和侵染拟南芥及其种子的消毒与筛选
一、拟南芥种子的消毒1、网筛：硅胶干燥过两三周的种子，用漏网筛滤几遍，尽量除去皮壳等杂质，倒入EP管中；2、消毒：于超净台上，用无菌枪头，向EP管中加入1ml的70% 酒精，并计时8分钟，在此期间不停的振荡，以使种子与酒精充分接触，最后12000rpm离心30s；3、洗涤：回到超净台上，酒精消毒双手，用无菌枪头将70% 酒精吸出，更换无菌枪头，吸取1ml无菌水加入管中，反复颠倒振荡，以使种子与无菌水充分接触，最后12000rpm离心30s；重复上述操作两次；4、春化：无菌枪头吸取1ml无菌水，加到种子EP管中，放入4℃冰箱中三天。
二、表达载体克隆构建转化农杆菌1、冲洗电击杯：水龙头下流水冲洗3min以上；于超净台上无菌水冲洗：用无菌蓝枪头将无菌水加入电击杯中，然后吸出并打入电击杯底部狭缝，如此重复吹打几次，再换成新的无菌水，如此反复3次；无水乙醇冲洗，同上反复3次；70%酒精冲洗，同上反复3次；最后无水乙醇冲洗1次，并平放于枪头盒上对着超净台风向吹干；2、加样：将已经吹干的电击杯放在冰上预冷，与此同时，从-20℃取出的质粒解冻后亦放在冰上预冷；然后从-80℃中取出已制备好的农杆菌感受态，解冻时离心几秒钟使其均匀分布（储存完整量为50ul）；准备工作做好后，白枪头吸取质粒1ul打入50ul农杆菌感受态细胞中，然后轻轻反复吹打使两者混匀，再用黄枪头全部吸出，沿着电击杯内壁或侧壁打入缝隙中，最后放于冰上保持低温；3、电击：插上电击仪电源，打开开关，调至Bacteria，调至Agr（农杆菌），将电击杯外壁突出面放在前面，并放在电击仪槽中，然后将槽推进去，使两边电击卡住，最后摁下Pulse脉冲进行电击，听到蜂鸣后取出电击杯放回冰上；4、复苏：于超净台上，沿电击杯内壁，往电击杯狭缝中，加入800ul无抗LB培养液，然后换用黄枪头，反复吸出培养液并吹打底部感受态细胞，使其悬浮起来，最后吸到2ml无菌EP管中，于28℃恒温箱中复苏1～2小时；5、涂板：复苏结束后，将菌液涂至含有利福平（菌种自身抗性）和表达载体抗性抗生素的固体培养基平板上，于28℃恒温箱中倒置过夜培养；三、侵染拟南芥植株1、栽种：将春化种子点在土里，隔两天浇一次水；2、打顶：拟南芥幼苗抽薹两三天后，去除其顶上花序，注意要避免伤及叶生花序；3、转化：打顶三四天后，进行侵染转化。
拟南芥转化流程
拟南芥转化流程拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，被广泛用于植物生物学研究。
拟南芥转化是指将外源基因导入拟南芥的过程，通过转化技术，可以使拟南芥表达特定的基因，从而研究基因功能、调控机制以及植物生长发育等方面的问题。
下面将详细介绍拟南芥转化的流程。
一、前期准备工作在进行拟南芥转化之前，首先需要准备一些实验材料和试剂。
这些包括拟南芥种子、培养基、细菌菌株、质粒载体等。
同时还需要准备一些实验器材，如离心管、琼脂糖凝胶、PCR仪等。
二、质粒构建在进行拟南芥转化之前，需要构建含有目标基因的质粒。
质粒通常由多个部分组成，包括启动子、目标基因、选择标记等。
在构建质粒时，需要使用PCR技术扩增目标基因，并经过酶切、连接、转化等步骤，最终得到完整的质粒。
三、细菌转化和筛选构建好的质粒需要通过细菌转化来扩增。
将质粒导入适当的细菌菌株中，利用培养基和培养条件培养细菌，使其扩增质粒。
之后，通过筛选等手段，得到含有目标质粒的细菌菌落。
四、DNA提取和验证从筛选出的细菌菌落中提取质粒DNA，可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行提取。
提取得到的DNA需要进行酶切鉴定，通过PCR扩增目标基因进行验证。
同时，还可以使用限制性片段长度多态性（RFLP）等技术对质粒进行进一步的验证。
五、拟南芥转化得到验证合格的质粒后，就可以进行拟南芥转化了。
常用的转化方法有农杆菌介导法和冷冻法。
在农杆菌介导法中，将构建好的质粒导入农杆菌中，然后将农杆菌与拟南芥叶片进行共培养，利用农杆菌的侵染能力将质粒导入拟南芥细胞中。
而冷冻法则是将拟南芥种子与农杆菌共同处理，通过冷冻和解冻的过程，使质粒导入拟南芥种子中。
六、筛选和培养转化完成后，需要对转化成功的拟南芥进行筛选和培养。
通常会在培养基中添加适当的选择标记，如抗生素等，以筛选出含有目标基因的拟南芥植株。
筛选出的植株可以继续培养，在适当的生长条件下进行生长发育观察和功能验证。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3 101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。
拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。
本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。
该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。
通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。
标签：植物转基因；农杆菌；浸花法植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。
利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。
植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。
基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。
农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。
农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。
科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。
利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。
浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。
这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。
农杆菌花序侵染的方法
我们一般采用：花序浸染法转化拟南芥（1）种植：选择吸水性好，土质松软的至石配合营养土（1：）作为拟南芥种植土壤。
直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗。
播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。
（2）去顶：在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。
适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。
（3）配制浸染液：在5%的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD=0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。
100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆（9cm）植株。
在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05%（500ul/L），如果产生表面活性剂的毒性现象（浸过部分发黄或死亡），将浓度降至0.02%。
戚老师实验室用十万分之一（50ul/L）（4）浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中2-3s，同时轻轻旋转。
（5）暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。
（6）浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。
（7）种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。
（8）转基因种子筛选：在含有Kan抗生素的平板上培养浸染后所得种子。
40mg的种子大约200颗于含kan 10-50μg/ml的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。
根据生长状况判断是否为转基因种子。
成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。
非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。
（9）转基因植株转土栽培。
转基因种子在MS+kan平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。
2.5转基因拟南芥纯合子筛选由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为后续生理性状实验需要，将T0代转基因种子培育至T2代，利用抗性筛选得到纯合子。
根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在MS+Kanr（50μg/ml）平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。
拟南芥侵染
拟南芥侵染
拟南芥侵染
3、用侵染液重悬菌体
4、将拟南芥花序浸到侵染液中，10-15s，然后将拟南芥取出放入暗箱中，上面覆膜保湿，暗培1天；
5、将拟南芥取出，长日照培养，隔5-7
天再侵染一次。
注意：
1、用于侵染的拟南芥必须健壮，首次侵染前应将已有果荚剪掉，
2、侵染前应完全浇透基质，侵染后应将
营养钵平放，不要让侵染液滴到拟南芥叶子上，否则叶片会死亡，同时应尽快放入暗箱中，避免花序风干，侵染期间注意保温；
3、暗培养时间不宜太长，否则会死亡；二次侵染要根据植株的生长状况而定，没有具体时间限制；
4、侵染拟南芥应使用对拟南芥敏感的农杆菌菌株（GV3101或c58c1）；
5、Silwet L-77有毒，破坏质膜，使用时戴手套。
园艺-拟南芥侵染和筛选的流程
园艺-拟南芥侵染和筛选的流程1摇菌（1）小摇：在超净工作台中取出无菌离心管，加入4ml纯净LB 液体培养基，加入4ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入8ul 10mg/ml 浓度的利福霉素，加入阳性菌菌液，摇匀；在摇床中28℃培养2天；（2）大摇：在250ml三角瓶中加入150ml纯净LB液体培养基，加入150ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入300ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入1.5ml菌液，过夜摇菌。
2配侵染液（1）1L超纯水中加入10g蔗糖及40ul表面活性剂Silwet L-77，磁力加热搅拌器搅拌均匀；（2）大摇后的菌液用分光光度计测OD600，用离心后的上清液作为对照，菌液OD600在0.8~1.0之间时，可以进行下一步；（3）将菌液倒入50ml圆底离心管中，常温4000g离心10分钟，收集菌株；（4）倒掉上清，加入少许侵染液，用移液器把菌打散打匀，倒入侵染液中。
3农杆菌花序侵染（1）托盘垫上报纸，润湿，取八盆培养良好且适合侵染的拟南芥，每盆四株；（2）将全部的花全浸到侵染液中，全部的花均需浸湿，若花无法碰到侵染液，则用戴手套的手浸湿，每盆浸湿2分钟；（3）然后将植株迅速平躺放到托盘中，用黑塑料袋盖住；（4）暗处理24小时后正常培养；（5）用于摇菌的三角瓶，侵染用的瓶子、50ml插口圆底离心管及剩下的侵染液与菌液上清均需高温高压灭菌。
4收种子侵染后的拟南芥苗正常培养，30天时收取第一批种子，40天时收取第二批种子，晒干7~10天。
5 筛选T1代转基因阳性植株5.1 选择性培养基筛选（1）将种子倒入10ml离心管中，加满拟南芥种子消毒液（0.5%SDS、0.8%NaClO），均匀打散种子，手摇振荡15分钟；（2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，将种子完全打散，振荡洗涤；（3）室温3000g离心2分钟，在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，重复进行五次洗涤过程；（4）加入0.2%琼脂糖悬浮种子，用移液器均匀涂在50ug/ml卡那霉素100ug/ml头孢菌素的MS固体培养基板上，每个板3ml，晾十五分钟，等水被板吸干后再封膜；（5）暗处理春化3d；（6）将选择性培养基上长出的T1代转基因阳性植株移到土中正常培养。
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植株准备：养的壮壮的，可以适时打顶，剪掉顶端，长更多侧枝。
1.冻融法转化农杆菌
1.1 目的质粒与农杆菌GV3101感受态混匀，冰上共孵育5-30min, 液氮中冻5min, 37℃5min, 冰上2min, 加入无抗性LB 28℃恢复培养2-4h, 涂相应抗性板，28℃培养24-48h.
2. 摇菌
2.1 PCR鉴定单克隆，挑选阳性单克隆接入2-3ml相应抗性LB中，小摇至橙黄色，约24-48h。
如果是保种的菌，最好也要小摇。
2.2 按0.5%-1%接种量接入~150ml相应抗性LB中，过夜至橙黄色。
2.3 收菌，5000rpm,10min（最好用250ml的离心瓶，50ml的离心管也可）。
菌体沉淀用等体积（大摇菌的LB体积, 不是沉淀的体积，收菌的时候在瓶子上画个线即可）5%蔗糖溶液（水溶）重悬，手晃、枪吹打、涡旋均可。
加入~0.1% （0.5‰上下100倍均可）Silwet,摇匀。
3.侵染
3.1 待侵染的植株剪去果荚和开放的花。
植株在前一天浇足水。
（可侵染前一天剪，不剪也是可以的）
3.2侵染液（5%蔗糖重悬的菌液）倒入比较浅的容器（枪头盒盖子、15cm培养皿或其他类似盒子均可）中。
3.3将保鲜膜铺在桌子上或地上，将植株的花序和茎（茎上的腋芽）浸入侵染液，静置30-60s,拿出放置于保鲜膜上，包起来（包住盆的一部分和植株全部），平着放入黑色塑料袋内或者盆内（遮光即可）。
18-22h后，揭去保鲜膜，正着放置生长即可。
如此时发现还有明显菌液，可晃一晃去除，令植株的花序不要黏在一起。
揭保鲜膜最好不要超过20h, 超过24h，花序蔫掉的比率会大大增加。
3.4 侵染后7-10天后可以进行第二次侵染。
这次坚决不能剪果荚和花！！！二次侵染前提是植株的花序顶端还很壮，还能开好多花，否则就等着花序蔫掉吧，切记切记！！！。