幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制

幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制

【摘要】目的建立一种快速检测抗H.pylori IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条，并优化制备中各关键步骤的实验条件。方法以柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金溶液，葡萄球菌A蛋白（SPA），制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。结果用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色。胶体金标记SPA的最低稳定浓度5μg/ml，最适稳定量为6μg/ ml。SPA标记的最适pH为6.0。以此试纸条检测临床血清标本与进口ELISA试剂盒比较，组间阳性率比较差异无显著性。结论胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。

【关键词】幽门螺杆菌；胶体金；免疫层析检测

Research on development of gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG

【Abstract】Objective Developing gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG and optimize the key experiment conditions.Methods Preparing the colloid gold particles of 20 nm which were coupled with Streptococcus protein A (SPA)，set up the gold immunochromatography test kit for serum H.pylori antibody

IgG.Results The spheroidal colloid gold particles of 20nm is shown in color of bright red.The minimal stable concentration (MSC) of gold- SPA is 5μg/ml，and the suitable stable concentration ( SSC) is 6μg/ml.The pH 6.0 is appropriate. 53 sera samples were tested by GICA and ELISA，there is on significant difference between two

methods.Conclusion The quality of gold immunochromatography test kit is associated with the factors，such as the quality and quantity of antigen or antibody，colloid gold particles，buffers，etc.

【Key words】helicobacter pylori;colloid gold;gold immunochromatographic assay

在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染的诊断中，细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。而血清学检测因其非侵入性、快速、准确，可同时处理大量标本，检测不同类型的抗体，在临床检验、基础研究中倍受青睐。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测（gold immunochromagraphy assay，GICA），操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和特殊设备，特别适于基层卫生单位使用。本研究预采用H.pylori超声全菌体抗原、葡萄球菌A蛋白（SPA）抗原，尝试研制一种根据双抗原夹心法检测原理检测血清、唾液中抗H.pylori的IgG抗体的胶体金免疫层析检测试剂，优化胶体金免疫层析快速诊断试纸条研制各关键步骤的实验条件，为进一步研制和开发奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

幽门螺杆菌菌种SS1为军事医学科学院微生物与流行病研究所保存；TSB肉汤（Tryptic soy broth）为DIFCO 公司产品；氯金酸（HAuCl4.H2O），上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O），北京北化精细化学品有限公司产品；葡萄球菌A蛋白（SPA）、牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma公司产品；聚乙二醇（PEG 20000），FLUKA公司产品;以上试剂均为分析纯。厌氧培养罐AnaeroPack Rectangular Jar为三菱化学公司产品。

1.2 方法

1.2.1 玻璃器皿的清洁

制备胶体金的所用容器均应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用MQ超纯水冲洗晾干备用。

1.2.2 胶体金颗粒的制备

取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01% 的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。

1.2.3 免疫胶体金复合物的制备

胶体金标记蛋白最低稳定浓度与最适稳定量的确定

目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至5.9～6.2，取11支洁净试管分装胶体金溶液（1ml/管）。将待标记蛋白质SPA 逐级稀释后（由2～10μg另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，混匀；5min后，在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置。依表1顺序进行。表1 胶体金标记SPA的最低稳定浓度实验（略）

(1)室温静置2h以上观察结果；(2)未加SPA的11号管为对照管；1号管既不加SPA也不加氯化钠溶液同样设为对照；(3)未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。

最适标记pH的确定

调节胶体金溶液pH依次为4、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，配合上述最低稳定量实验，确定标记蛋白的最佳标记pH。

SPA标记胶体金