细胞克隆形成实验

1．2．3克隆形成分析

(1)药物处理

T25培养瓶中细胞以基础培养基洗1遍，并在基础培养基中饥饿2d'时，然后

换回条件培养基，以恩度(200ng／m1)、顺铂(8pM)以及两药联合使用，标准

条件下孵育细胞6d,时。其中，涉及到恩度处理时，在饥饿后半程即以相应浓度

的恩度预处理细胞1小时。实验设对照(contr01)。

(2)细胞接种

吸弃培养基，胰酶工作液分别收集细胞，以条件培养基洗2遍后，将细胞悬

浮于条件培养基中，计数3次，取均值，调整细胞悬液浓度至1 x103／ml。6孔培养板中加入2．6ml条件培养／孔，在C02培养箱中平衡后，每孔加入0．4ml细胞悬液(400个细胞)，终体积为3ml。接种时十字方向摇晃培养板，振动培养板边，使

细胞尽量均匀分布。其中，涉及到恩度处理过的细胞，在接种过程中使用含有

200ng／ml,恩,度的条件培养基。

(3)细胞培养

细胞在标准条件下培养2～3周，每3天更换条件培养基，观察克隆形成情况。

其中，以恩度干预的细胞，换液时使用含有该浓度恩度的条件培养基。

(4)克隆染色

当细胞形成肉眼可见的克隆(每个克隆细胞数在50'--'150个左右)时终止培

养。弃去培养基，用DPBS(O．01moUL，pH 7．4)小心浸洗细胞2次后，加入甲醇lml／孔，固定15min后，弃去固定液，以流水缓慢冲洗干净，每孔加入lml的姬姆萨使用液染色30min，以流水缓慢洗去染色液，通风橱中干燥。

(5)克隆计数

将培养板放置在凝胶成像系统，使用可见光条件，以随机所带软件计数克

隆数目，扫描并保存图像。克隆形成率(％)=克隆数目／接种细胞数x100％。调

整后的克隆形成率(％)=克隆形成率(％)／对照组克隆形成率(％)。每种药物

处理的细胞样本接种3个复孔，独立重复3次实验。