海藻糖实验初步方案-1

海藻糖实验初步工艺

一、项目简介

海藻糖（Trehalose）是由两分子葡萄糖通过α-1,1糖苷键结合的非还原性双糖，无毒无害，具有非着色性、耐酸、耐热、低吸湿性等特性，具有抗辐射、防止蛋白质变性、稳定组织细胞结构与保鲜效果、抗冷冻保护、稳定物料中超氧化物歧化酶等诸多功能。当生物细胞处于干燥、高温、高压等恶劣环境，海藻糖对生物和生物大分子有良好的非特异性保护作用，在科学界素有“生命之糖”的美誉。随着其独特的生物学性质及功能的发现，海藻糖逐渐成为国际上研究热点。

二、海藻糖国内外市场概况

海藻糖在食品工业、生命科学、医药、农业、化妆品工业等领域都有着广阔的应用前景。2000年，美国FDA授予海藻糖GRAS(安全健康食品)，联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)食品添加剂联合专家委员会确认对海藻糖的每日允许摄入量(ADI)不需特别限制；2001年，欧盟批准海藻糖作为新型食品或食品添加剂进入其市场。海藻糖由此成为热门的产品，掀起了应用研究的高潮，在国际市场上的需求量连年剧增，至今已在欧洲、北美和亚洲国家被广泛应用于上万种商品中。估计今后几年，海藻糖国际市场的年需求量将达15万吨以上。

国际的海藻糖年产量约5万吨，经调研，国内的海藻糖年产量约4千吨，市场存在着严重的空缺。海藻糖的市场前景较好。

三、实验材料

1、菌株

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的海藻糖高产突变株A11:中国海洋大学实验室分离并保存。

2、培养基和试剂及仪器

YPD (Yeast Polypepton Dextrose)培养基：1.0%(w/v)酵母膏，2.0%(w/v) 葡萄糖，2.0%(w/v)蛋白胨。

YPS (Yeast polypepton starch)培养基：1.0%(w/v)酵母膏，2.0%(w/v)可溶性淀粉，2.0%(w/v)蛋白胨。

黄豆饼粉水解液培养基：4.0%(w/v)黄豆饼粉水解液，1.0%(w/v)可溶性淀粉。

Biostat B2 5L 发酵罐(德国B. Braun 生产)

平板超滤系统(MILLIPORE,MINTANTM Ⅱ)，Cole-Parmer Instrument Company

两套离子交换柱(30mm x 50mm)

旋转蒸发仪，RE-524，上海亚容生化仪器厂生产

732型大孔阳离子树脂，201 x 7型阴离子树脂

SephadexG-50为Pharmacia公司产品，其余试剂除注明外均为国产分析纯试剂。

四、实验方法

1、摇瓶振荡培养

种子液培养：从YPD平板上分别挑取扣囊复膜酵母A11-a和突变菌株A11-b 单菌落接种到含50.0mL的YPS液体培养基的250mL三角瓶中，在30℃和200 rpm 下振荡培养24 h。取5.0mL培养好的种子液转接到含45.0 mL的2.0% (w/v)木薯淀粉的豆饼粉水解液培养基的250-mL三角瓶中，在30℃在200 rpm下振荡培养96 h。

2、发酵培养

2.1、豆饼粉水解液的制备

把32.0 g豆饼粉中加到250 mL 0.25 mol/L HCl溶液中，把该混合物在14磅下高温灭菌25 min，冷却，然后用浓度为1.0 mol/L的NaOH溶液调pH值至5.5，最后在12,000 g下离心8 min得上清液，上清液用蒸馏水定容至800 mL，此溶液为4.0%豆饼粉水解液。

2.2、种子液培养：从YPD琼脂平板上挑取突变菌株A11-b单菌落接种到含100.0 mL YPS液体培养基的500-mL三角瓶中，在28℃和200 rpm下振荡培养24 h。把400.0 mL种子液接入含

3.6 L 2.0% (w/v)木薯淀粉的豆饼粉水解液培养基的SY-3005 B 5 L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件如下：转速200 rpm、通气量4 L/min、温度28℃、培养时间96 h。

3、海藻糖的纯化

3.1、海藻糖粗制品的制备

扣囊复膜酵母A11-b突变株的发酵培养，收集菌液，5000×g和4℃下离心10 min收获细胞，再用冷冻灭菌蒸馏水通过离心洗涤细胞3次。洗涤好的5.0 mL

菌液细胞重悬在灭菌蒸馏水中，在37℃下振荡抽提2 h，在5000×g和常温下离心10 min取上清抽提液，用同样的方法重复3次抽提后所有抽提液混合在一起。1000 mL提取液在用玻璃棒搅拌情况下加入2000-3000 mL冷冻无水乙醇(或95％乙醇)，并充分混匀，再加入适量的KCl饱和液（10-20g/L），混匀后放置4℃下过夜，在13600×g和4℃下离心10 min，去上清，得到海藻糖混合沉淀物，海藻糖沉淀物以无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤一次，洗涤过的海藻糖沉淀物放80℃烘箱内烘干，直到重量不再发生变化为止，干燥的沉淀物作为海藻糖粗制品。

3.2、除蛋白质

称取上述的海藻糖粗制品5.0 g重新溶于25.0 mL蒸馏水中，加热至海藻糖

完全溶解于蒸馏水中为止，再用浓NaOH或 H

2SO

4

调节pH值至8.0。为了除去蛋

白质，加入0.5 g胰蛋白酶，37℃保温24 h用来消化蛋白质。经胰蛋白酶处理过的粗制海藻糖溶液在13600×g下离心10 min，再以Sevag方法继续除去上清液中的蛋白质（Sevag法操作均在4℃下进行）（Chi et al., 2007），按上清液:Sevag试剂（氯仿:正丁醇=4:1）=4:1的比例加入预冷的Sevag试剂，在4℃的摇床上剧烈振荡30 min，在13600×g和4℃下离心10 min，混合液分三层，上层为海藻糖溶液，下层为Sevag试剂，中间为变性蛋白质。收集上层海藻糖溶液在旋转蒸发仪中浓缩除去溶液中的有机溶剂。

3.3、脱色素

除去蛋白质的海藻糖溶液还含有一些天然色素，主要呈淡黄褐色。为了除去这些天然色素，海藻糖溶液用浓氨水调节pH值至7.0，再逐滴加入25％（V/V）的H2O2，直至海藻糖溶液由淡黄褐色转变为淡黄色为止，然后装入10 kDa的透析袋，在蒸馏水中透析24 h，期间不断换水。透析后的海藻糖溶液中加入无水乙醇至有沉淀生成，再放置在4℃下过夜，在13600×g和4℃下离心10 min，弃上清液，得到海藻糖沉淀。沉淀物再用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤一次，然后放在100℃的烘箱中，烘干至重量不再变化为止。

3.4、过分子筛层析

经过上述处理过的海藻糖25 mg溶于1.0 mL 0.1 M的NaCl溶液中，在13600×g和4℃下离心10 min后，上Sephadex G50柱，以0.1 M的NaCl溶液洗脱，流速为 2 mL/min。每管收集 2 mL，各收集管分别取0.1 mL，用硫酸-蒽酮法