海藻糖实验初步方案-1

海藻糖实验初步工艺

一、项目简介

海藻糖（Trehalose）是由两分子葡萄糖通过α-1,1糖苷键结合的非还原性双糖，无毒无害，具有非着色性、耐酸、耐热、低吸湿性等特性，具有抗辐射、防止蛋白质变性、稳定组织细胞结构与保鲜效果、抗冷冻保护、稳定物料中超氧化物歧化酶等诸多功能。当生物细胞处于干燥、高温、高压等恶劣环境，海藻糖对生物和生物大分子有良好的非特异性保护作用，在科学界素有“生命之糖”的美誉。随着其独特的生物学性质及功能的发现，海藻糖逐渐成为国际上研究热点。

二、海藻糖国内外市场概况

海藻糖在食品工业、生命科学、医药、农业、化妆品工业等领域都有着广阔的应用前景。2000年，美国FDA授予海藻糖GRAS(安全健康食品)，联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)食品添加剂联合专家委员会确认对海藻糖的每日允许摄入量(ADI)不需特别限制；2001年，欧盟批准海藻糖作为新型食品或食品添加剂进入其市场。海藻糖由此成为热门的产品，掀起了应用研究的高潮，在国际市场上的需求量连年剧增，至今已在欧洲、北美和亚洲国家被广泛应用于上万种商品中。估计今后几年，海藻糖国际市场的年需求量将达15万吨以上。

国际的海藻糖年产量约5万吨，经调研，国内的海藻糖年产量约4千吨，市场存在着严重的空缺。海藻糖的市场前景较好。

三、实验材料

1、菌株

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的海藻糖高产突变株A11:中国海洋大学实验室分离并保存。

2、培养基和试剂及仪器

YPD (Yeast Polypepton Dextrose)培养基：1.0%(w/v)酵母膏，2.0%(w/v) 葡萄糖，2.0%(w/v)蛋白胨。

YPS (Yeast polypepton starch)培养基：1.0%(w/v)酵母膏，2.0%(w/v)可溶性淀粉，2.0%(w/v)蛋白胨。

黄豆饼粉水解液培养基：4.0%(w/v)黄豆饼粉水解液，1.0%(w/v)可溶性淀粉。

Biostat B2 5L 发酵罐(德国B. Braun 生产)

平板超滤系统(MILLIPORE,MINTANTM Ⅱ)，Cole-Parmer Instrument Company

两套离子交换柱(30mm x 50mm)

旋转蒸发仪，RE-524，上海亚容生化仪器厂生产

732型大孔阳离子树脂，201 x 7型阴离子树脂

SephadexG-50为Pharmacia公司产品，其余试剂除注明外均为国产分析纯试剂。

四、实验方法

1、摇瓶振荡培养

种子液培养：从YPD平板上分别挑取扣囊复膜酵母A11-a和突变菌株A11-b 单菌落接种到含50.0mL的YPS液体培养基的250mL三角瓶中，在30℃和200 rpm 下振荡培养24 h。取5.0mL培养好的种子液转接到含45.0 mL的2.0% (w/v)木薯淀粉的豆饼粉水解液培养基的250-mL三角瓶中，在30℃在200 rpm下振荡培养96 h。

2、发酵培养

2.1、豆饼粉水解液的制备

把32.0 g豆饼粉中加到250 mL 0.25 mol/L HCl溶液中，把该混合物在14磅下高温灭菌25 min，冷却，然后用浓度为1.0 mol/L的NaOH溶液调pH值至5.5，最后在12,000 g下离心8 min得上清液，上清液用蒸馏水定容至800 mL，此溶液为4.0%豆饼粉水解液。

2.2、种子液培养：从YPD琼脂平板上挑取突变菌株A11-b单菌落接种到含100.0 mL YPS液体培养基的500-mL三角瓶中，在28℃和200 rpm下振荡培养24 h。把400.0 mL种子液接入含

3.6 L 2.0% (w/v)木薯淀粉的豆饼粉水解液培养基的SY-3005 B 5 L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件如下：转速200 rpm、通气量4 L/min、温度28℃、培养时间96 h。

3、海藻糖的纯化

3.1、海藻糖粗制品的制备

扣囊复膜酵母A11-b突变株的发酵培养，收集菌液，5000×g和4℃下离心10 min收获细胞，再用冷冻灭菌蒸馏水通过离心洗涤细胞3次。洗涤好的5.0 mL

菌液细胞重悬在灭菌蒸馏水中，在37℃下振荡抽提2 h，在5000×g和常温下离心10 min取上清抽提液，用同样的方法重复3次抽提后所有抽提液混合在一起。1000 mL提取液在用玻璃棒搅拌情况下加入2000-3000 mL冷冻无水乙醇(或95％乙醇)，并充分混匀，再加入适量的KCl饱和液（10-20g/L），混匀后放置4℃下过夜，在13600×g和4℃下离心10 min，去上清，得到海藻糖混合沉淀物，海藻糖沉淀物以无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤一次，洗涤过的海藻糖沉淀物放80℃烘箱内烘干，直到重量不再发生变化为止，干燥的沉淀物作为海藻糖粗制品。

3.2、除蛋白质

称取上述的海藻糖粗制品5.0 g重新溶于25.0 mL蒸馏水中，加热至海藻糖

完全溶解于蒸馏水中为止，再用浓NaOH或 H

2SO

4

调节pH值至8.0。为了除去蛋

白质，加入0.5 g胰蛋白酶，37℃保温24 h用来消化蛋白质。经胰蛋白酶处理过的粗制海藻糖溶液在13600×g下离心10 min，再以Sevag方法继续除去上清液中的蛋白质（Sevag法操作均在4℃下进行）（Chi et al., 2007），按上清液:Sevag试剂（氯仿:正丁醇=4:1）=4:1的比例加入预冷的Sevag试剂，在4℃的摇床上剧烈振荡30 min，在13600×g和4℃下离心10 min，混合液分三层，上层为海藻糖溶液，下层为Sevag试剂，中间为变性蛋白质。收集上层海藻糖溶液在旋转蒸发仪中浓缩除去溶液中的有机溶剂。

3.3、脱色素

除去蛋白质的海藻糖溶液还含有一些天然色素，主要呈淡黄褐色。为了除去这些天然色素，海藻糖溶液用浓氨水调节pH值至7.0，再逐滴加入25％（V/V）的H2O2，直至海藻糖溶液由淡黄褐色转变为淡黄色为止，然后装入10 kDa的透析袋，在蒸馏水中透析24 h，期间不断换水。透析后的海藻糖溶液中加入无水乙醇至有沉淀生成，再放置在4℃下过夜，在13600×g和4℃下离心10 min，弃上清液，得到海藻糖沉淀。沉淀物再用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤一次，然后放在100℃的烘箱中，烘干至重量不再变化为止。

3.4、过分子筛层析

经过上述处理过的海藻糖25 mg溶于1.0 mL 0.1 M的NaCl溶液中，在13600×g和4℃下离心10 min后，上Sephadex G50柱，以0.1 M的NaCl溶液洗脱，流速为 2 mL/min。每管收集 2 mL，各收集管分别取0.1 mL，用硫酸-蒽酮法

（Stewart , 1982）检测海藻糖含量，记录数据，绘出洗脱曲线。把在海藻糖吸收峰上的各管合在一起，再上Sephadex G-25柱用蒸馏水洗脱，进行脱盐，含海藻糖的洗脱液在-20℃下放2–3d，然后在-50℃下冻干。

4、海藻糖测定

4.1、海藻糖藻的提取和定量测定

蒽酮溶液配制：称取200 mg蒽酮粉末放三角瓶，放冰水中，按比例加入100 mL75%浓硫酸，用磁力搅拌棒在冰浴中充分搅拌，至蒽酮充分溶解，现配现用。

测定：取5ml菌液，其中的菌体用冰冻的蒸馏水在4000rpm，5min的条件下离心洗涤3次，加入4ml 0.5M的三氯乙酸(TCA)，混匀后在冰浴中放置20分钟，其间每5分钟振荡混匀一次。混合液在4000rpm下离心5分钟，收集上清液。剩下的菌体再按上述方法用4ml 0.5M TCA提取两次，共得12ml提取液。稀释后用蒽酮法[40]测定提取液中海藻糖的含量。

4.2、细胞干重的测定

取5.0 mL培养的菌液在5000×g和4℃下离心10min收获细胞，再用蒸馏水通过离心洗涤细胞，重复3次。然后，离心管中细胞在100℃下烘干，直到细胞的重量不再变化为止。

4.3、发酵培养下还原糖和总糖含量的测定

4.3.1、还原糖浓度的测定

取适量菌液，4000rpm离心5min，收集上清液，用Nelson-Somogyi法测定上清液中的还原糖浓度，见参考文献[40]。

4.3.2、总糖含量的测定

A11-b突变株发酵液总糖含量是通过测定发酵液被完全酸解后所含还原糖量换算得到的（Chi et al., 2001）。取经过3000×g、4℃离心5 min的发酵液上清10 mL，加入10 mL 25%的HCl和30 mL蒸馏水，混匀后在100℃水浴中煮3 h，经适当稀释后，用上述的Nelson-Somogyi方法测定混合液中的还原糖含量，重复三次。

4.4、海藻糖的纯度鉴定

4.4.1、高效液相色谱(HPLC)分析

从扣囊复膜酵母A11-b细胞中提取纯化的海藻糖和购自Sigma的海藻糖标准

品用Agilent Zorbax NH2 column (5 μm) (4.6×250 mm)进行高效液相色谱分析来确定纯度。高效液相色谱条件：

柱温：35℃

样品体积：40.0 μL

检测器：DAD（200nm）

流动相：乙腈-水（7:3）

样品浓度：5.0 mg/mL

流速：1.0 mL/min

4.4.2、紫外扫描检测

将经过上述处理过的海藻糖配制成浓度为1 mg/mL的溶液，使用可见紫外分光光度仪UV-2102在波长范围170－400 nm内进行扫描。

4.5、海藻糖标准曲线的制作

精确称取已经干燥的海藻糖100 mg，溶于1000 mL蒸馏水中，为海藻糖标准液。分别取7支试管，取海藻糖标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL 各加入比色管中，再依次加入蒸馏水1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.4、0.2 mL，然后各管分别加入5 mL配制好的蒽酮溶液，迅速放入冰块中冷却，然后所有比色管放在沸水浴中加热10 min，取出后冷却后在波长620 nm处测定吸光度。空白对照即以蒸馏水代替糖溶液。然后以620 nm处的光吸收值为横坐标，以1 mL 样品中海藻糖的量为纵坐标，绘制标准曲线。

取5 mL菌液，其中的菌体用冰冻的蒸馏水在4000 g，5 min的条件下离心洗涤3次，加入4 mL 0.5 mol/L的三氯乙酸（TCA），混匀后在冰浴中放置20 min，其间每5 min振荡混匀一次。混合液在4000 g下离心5 min，收集上清液。剩下的菌体再按上述方法用4 mL 0.5 mol/LTCA提取两次，共得12 mL提取液。稀释后用蒽酮法测定提取液中海藻糖的含量。把稀释好的1 mL提取液加在盛有5 mL 蒽酮的试管里，把盛有提取液和蒽酮的试管在沸水中煮10 min，冷却后在620 nm 下读其吸光值，然后按照标准曲线得出恩酮含量。按照上述方法重复测3次.

5、海藻糖的精制工艺

发酵结束后菌体→热蒸馏水提取→离心→上清液超滤澄清→阴阳离子树脂脱盐脱色→蒸发浓缩→结晶→过滤洗涤→干燥。

5.1、热蒸馏水提取海藻糖

用事先称重的离心管取5ml培养液，离心去上清液后用蒸馏水洗涤菌体两次再次称重，计算菌体湿重。

按菌体湿重与蒸馏水体积之比为1：8的比例加入蒸馏水，80℃水浴30min。然后离心弃菌体，将上清液稀释一定倍数后用蒽酮法测海藻糖量(占菌体干重百分数)。

5.2、超滤澄清

提取液中仍含有一些可溶于水的多糖类和蛋白质，采用截流量为5Kda的超滤膜超滤，以除去分子量较大的物质。

5.3、阴阳离子树脂脱色脱盐

本试验采用的是201X7型阴离子树脂和732型阳离子树脂。先将阴阳离子树脂按常规方法预处理及装柱，然后将两个柱子串联在一起形成一个密闭系统，最后用蒸馏水将串联柱平衡至中性。

上柱前一定要将提取液的pH调至 6.0左右，上注时提取液流速控制在3.0ml/min。不断采样检测流出液中有无海藻糖，当流出液中含有海藻糖时开始收集，直到流出液中再一次不含海藻糖时停止收集。

5.4、蒸发浓缩

采用常温浓缩和旋转蒸发仪真空浓缩相结合的方法，其间不断检测海藻糖含量，直至将提取液浓缩至海藻糖在样液中的含量在20%-50%之间。

5.5、结晶

当提取液内的海藻糖含量达到20%-50%时，加入4倍体积的无水乙醇，在常温下进行结晶。

5.6、离心和干燥

离心得到的晶体用少量无水乙醇冲洗。在40-50℃下干燥，得到海藻糖晶体。

5.7、HPEAC检测

用高效阴离子交换色谱(HPEAC)检测从酵母中精制的海藻糖，和Sigma公司的海藻糖相对照。使用的是Carbo Pac PA1 阴离子交换柱(4 x 250mm)。

6、主要参考文献

1、Zhenming Chi, et al, Trehalose accumulation from soluble starch by Saccharomycopsis fibuligera sdu, Enzyme and Microbial Technology, 28(2001) 240-245

2、Zhenming Chi, et al, Enhanced conversation of soluble starch to trehalose by a mutant of Saccharomycopsis fibuligera sdu, Journal of biotechnology, 00(2003) 1-7