Western blot 实验介绍及流程
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切胶板、黑白夹板、海绵垫等
• 电泳仪
用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定 性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹 ）实验中非常重要的部分。
Western blot 实验原理
• Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即组织 细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过化学反 应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂（如酶、金 属离子、同位素）显示一定的颜色或发光来对组织细胞
3 The blot is incubated with a generic protein (such as milk proteins or BSA) which binds to any remaining sticky places on the nitrocellulose. 4 An antibody that is specific for the protein of interest (the primary antibody - Ab1) is added to the nitrocellulose sheet and reacts with the antigen. Only the band containing the protein of interest binds the antibody, forming a layer of antibody molecules
内目的蛋白定性及半定量的研究。
抗原
生物素标记 的二抗 一抗
ECL发光试剂
Western blot 检测蛋白表达实验流程
提取总蛋白
蛋白浓度测定 SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳
一抗
封闭
转膜
洗涤
二抗
洗涤
分析
扫描
ECL检测
SDS-PAGE电泳的基本原理
SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由 Weber和Osborn进一步完善。 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，是在PAGE凝胶中 引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-）， SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原 剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物（电泳样品 加入样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟）。由于结合大 量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白 质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS-PAGE胶 中的迁移率主要取决于其分子量的大小。
（7）电泳
50V1h, 100V2.5h，根据分子量的大小确定电压和时间，一般溴酚蓝离胶下１cm停止电泳，上槽 接负极，下槽接正极
Western blot 实验流程
• 2 Electroblotting transfers the separated proteins from the gel to the surface of a nitrocellulose membrane.
据一抗的种属来源，如： 一抗是兔抗大鼠目的蛋白 的抗体，则二抗应选择山 羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素 或酶。
Western blot 实验流程
6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase ( HRP ), which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer.
（3）配制浓缩胶
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶
（4）灌浓缩胶
倒掉分离胶上的水或正丁醇之后，倒置吸净残留溶液，灌注浓缩胶，将梳子插好,胶凝固好后有胶 条的国产槽需要去掉胶条（浓缩胶与分离胶一般比例为1：3）
（5）加Tris-甘氨酸电泳缓冲液
足量
（6）上样
蛋白质含量要适量，上样总体积要适量
仪器培训
Western blot 实验介绍 及流程
Bio-rad垂直电泳、电转装置
• 目的与要求
掌握垂直电泳、电转的基本原理与操作步骤
• 培训内容
熟悉western-blot 与SDS-PAGE的基本原理与实验流程
• 考核题目
Bio-rad垂直电泳、电转装置
• 电泳槽
玻璃板、梳子、加样校准架等
• 电转移槽
Western blot 实验流程
1 A protein sample is subjected to electrophoresis on an SDSpolyacrylamide gel.
SDS-PAGE电泳操作步骤
（1）配制分离胶
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶
（2）灌分离胶
灌胶之上轻轻加一层水或正丁醇液
一抗孵育：必须选择可以抗抗原 种属的一抗。如做大鼠目的蛋白 的检测，则我们选择的一抗可以 是来自兔、人、小鼠的抗大鼠的 抗体。一抗浓度及孵育时间、温 度很重要。
Western blot 实验流程
5 Following several rinses for removal of non-specifically bound Ab1, the Ab1-antigen complex on the nitrocellulose sheet is incubated with a second antibody (Ab2), which specifically recognizes the Fc domain of the primary antibody and binds it. Ab2 is radioactively labeled, or is covalently linked to a reporter enzyme, which allows to visualize the protein-Ab1-Ab2 complex . 二抗孵育：二抗的选择根
电转操作步骤
（1）剥胶
用切胶板切去浓缩胶和多余的分离胶
（2）准备滤纸和硝酸纤维素膜
切滤纸和膜时一定要戴手套，大小与胶一致
（3）浸泡滤纸、膜和海绵垫
用转移液（含甲醇）浸泡，开门通风
（4）制备“三明治”
制备每一层时注意赶气泡
（5）电转
75V，1.5h，在冰浴中进行，黑板对黑极（－），白板对白极（＋）
பைடு நூலகம்
Western blot 实验流程
ECL显色：ECL试
剂与过氧化物酶 结合后发光后， 可用仪器自动检 测或在暗室内用 X-光片将其记录 下来。
Western blot 实验结果与分析
将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与 内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果
c-fos actin
protein levels of c-fos in livers
2.5
62kD 42kD
**
fold increase
2 1.5 1 0.5 0 0 14 28
SO 2 dose (mg/m )
3
56
考核题目
Bio-rad垂直电泳、电转装置的主要用途是什么？ Bio-rad垂直电泳、电转装置主要由哪几部分构成？ SDS-PAGE电泳中蛋白质迁移速率的快慢取决于什么？ SDS-PAGE电泳的操作步骤是什么？注意事项有哪些？ SDS-PAGE电转移的操作步骤是什么（详细列出“三明治” 的先后顺序)？注意事项有哪些？ 6. Western-Blot的基本原理是什么？ 1. 2. 3. 4. 5.
• 电泳仪
用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定 性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹 ）实验中非常重要的部分。
Western blot 实验原理
• Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即组织 细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过化学反 应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂（如酶、金 属离子、同位素）显示一定的颜色或发光来对组织细胞
3 The blot is incubated with a generic protein (such as milk proteins or BSA) which binds to any remaining sticky places on the nitrocellulose. 4 An antibody that is specific for the protein of interest (the primary antibody - Ab1) is added to the nitrocellulose sheet and reacts with the antigen. Only the band containing the protein of interest binds the antibody, forming a layer of antibody molecules
内目的蛋白定性及半定量的研究。
抗原
生物素标记 的二抗 一抗
ECL发光试剂
Western blot 检测蛋白表达实验流程
提取总蛋白
蛋白浓度测定 SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳
一抗
封闭
转膜
洗涤
二抗
洗涤
分析
扫描
ECL检测
SDS-PAGE电泳的基本原理
SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由 Weber和Osborn进一步完善。 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，是在PAGE凝胶中 引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-）， SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原 剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物（电泳样品 加入样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟）。由于结合大 量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白 质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS-PAGE胶 中的迁移率主要取决于其分子量的大小。
（7）电泳
50V1h, 100V2.5h，根据分子量的大小确定电压和时间，一般溴酚蓝离胶下１cm停止电泳，上槽 接负极，下槽接正极
Western blot 实验流程
• 2 Electroblotting transfers the separated proteins from the gel to the surface of a nitrocellulose membrane.
据一抗的种属来源，如： 一抗是兔抗大鼠目的蛋白 的抗体，则二抗应选择山 羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素 或酶。
Western blot 实验流程
6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase ( HRP ), which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer.
（3）配制浓缩胶
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶
（4）灌浓缩胶
倒掉分离胶上的水或正丁醇之后，倒置吸净残留溶液，灌注浓缩胶，将梳子插好,胶凝固好后有胶 条的国产槽需要去掉胶条（浓缩胶与分离胶一般比例为1：3）
（5）加Tris-甘氨酸电泳缓冲液
足量
（6）上样
蛋白质含量要适量，上样总体积要适量
仪器培训
Western blot 实验介绍 及流程
Bio-rad垂直电泳、电转装置
• 目的与要求
掌握垂直电泳、电转的基本原理与操作步骤
• 培训内容
熟悉western-blot 与SDS-PAGE的基本原理与实验流程
• 考核题目
Bio-rad垂直电泳、电转装置
• 电泳槽
玻璃板、梳子、加样校准架等
• 电转移槽
Western blot 实验流程
1 A protein sample is subjected to electrophoresis on an SDSpolyacrylamide gel.
SDS-PAGE电泳操作步骤
（1）配制分离胶
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶
（2）灌分离胶
灌胶之上轻轻加一层水或正丁醇液
一抗孵育：必须选择可以抗抗原 种属的一抗。如做大鼠目的蛋白 的检测，则我们选择的一抗可以 是来自兔、人、小鼠的抗大鼠的 抗体。一抗浓度及孵育时间、温 度很重要。
Western blot 实验流程
5 Following several rinses for removal of non-specifically bound Ab1, the Ab1-antigen complex on the nitrocellulose sheet is incubated with a second antibody (Ab2), which specifically recognizes the Fc domain of the primary antibody and binds it. Ab2 is radioactively labeled, or is covalently linked to a reporter enzyme, which allows to visualize the protein-Ab1-Ab2 complex . 二抗孵育：二抗的选择根
电转操作步骤
（1）剥胶
用切胶板切去浓缩胶和多余的分离胶
（2）准备滤纸和硝酸纤维素膜
切滤纸和膜时一定要戴手套，大小与胶一致
（3）浸泡滤纸、膜和海绵垫
用转移液（含甲醇）浸泡，开门通风
（4）制备“三明治”
制备每一层时注意赶气泡
（5）电转
75V，1.5h，在冰浴中进行，黑板对黑极（－），白板对白极（＋）
பைடு நூலகம்
Western blot 实验流程
ECL显色：ECL试
剂与过氧化物酶 结合后发光后， 可用仪器自动检 测或在暗室内用 X-光片将其记录 下来。
Western blot 实验结果与分析
将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与 内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果
c-fos actin
protein levels of c-fos in livers
2.5
62kD 42kD
**
fold increase
2 1.5 1 0.5 0 0 14 28
SO 2 dose (mg/m )
3
56
考核题目
Bio-rad垂直电泳、电转装置的主要用途是什么？ Bio-rad垂直电泳、电转装置主要由哪几部分构成？ SDS-PAGE电泳中蛋白质迁移速率的快慢取决于什么？ SDS-PAGE电泳的操作步骤是什么？注意事项有哪些？ SDS-PAGE电转移的操作步骤是什么（详细列出“三明治” 的先后顺序)？注意事项有哪些？ 6. Western-Blot的基本原理是什么？ 1. 2. 3. 4. 5.